Registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale Etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate Endings
Summary
A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
Abstract
Una tecnica di dissezione e la registrazione romanzo è descritto per la cottura monitoraggio afferente evocato da spostamento meccanico dei capelli nella pinna del mouse. La tecnica è molto conveniente e facilmente intrapresa con materiali comunemente presenti nella maggior parte dei laboratori di elettrofisiologia, o facilmente acquistati. La dissezione è semplice e veloce, con lo spostamento meccanico fornito da un generico wafer electroceramic controllato dal software proprietario. Lo stesso software registra anche e analizza l'uscita electroneurogram. La registrazione dell'attività del nervo evocata è attraverso un amplificatore differenziale commerciale collegato a microelettrodi di vetro standard fuoco lucido. consigli utili sono dati per migliorare la qualità della preparazione, la stimolazione e le condizioni di registrazione per ottimizzare la qualità di registrazione. Il sistema è adatto per saggiare le proprietà elettrofisiologiche e ottiche di terminali lanceolate di terminazioni palizzate di follicoli piliferi, nonché lai risultati da loro manipolazione farmacologica e / o genetica. Un esempio di combinazione registrazione elettrica con stimolazione meccanica e marcatura con un colorante vitale styryl piridinio è dato.
Introduction
I terminali lanceolate di assoni sensitivi che innervano i follicoli piliferi nei mammiferi formano palizzate intorno l'epitelio capelli-albero. Il loro scopo è quello di rilevare spostamento meccanico dei peli che circondano. Essi sono un mix di rapido e lentamente adattando terminazioni che producono prevalentemente brevi sequenze di attività in risposta al movimento dei capelli. Attività cessa molto rapidamente quando il movimento si arresta, anche in presenza di spostamento continuato. Qui si descrive lo sviluppo di questo modello murino Pinna per gli studi correlativi della struttura e funzione nei terminali lanceolate. Il padiglione auricolare ha molte caratteristiche vantaggiose per lo studio di questi terminali. Innanzitutto, la pinna è essenzialmente due strati di pelle apposto back-to-back, con poco altro tessuto tra di interferire con l'accesso ai follicoli e terminali. La pelle è molto sottile e facilmente sezionato a causa di minime quantità di tessuto connettivo duro. L'innervazione è facilmente accessibile e identificabile. Mentre follicl capelliES sono presenti, sono relativamente poco distribuiti, facilitando la stimolazione di individui o piccoli gruppi di follicoli meccanicamente. Lo strato dermico sottostante sottile dà una buona accessibilità alle terminazioni nervose con farmaci farmacologici e coloranti. Questo li rende particolarmente ideale per gli studi di imaging usando la microscopia a fluorescenza. L'acquisizione di immagini può essere sia in terminali viventi, o dopo fissazione e successiva trasformazione istologica.
Le risposte dei neuroni meccanosensoriali innervano follicoli piliferi sono stati tradizionalmente studiati in roditori vibrisse 1,2 e, in misura minore, in preparazioni della pelle isolati 3,4. Questi hanno insegnato molto sui principi generali della fisiologia meccanosensoriali nelle terminazioni nervose che circondano il fusto del capello. La preparazione vibrissal permette il controllo squisito il movimento di un singolo follicolo pilifero. Tuttavia, può essere difficile decifrare l'uscita a causa della sua complessità, come vibrissalfollicoli contengono almeno 8 diversi tipi di anatomicamente distinti finale meccanosensoriali 5 e l'abbinamento di questi tipi morfologici a specifiche risposte elettrofisiologiche è ancora oggetto di controversia. Il / preparato nervo safeno pelle del mouse è più spesso utilizzato nel suo stato depilata di indagare le risposte tattili e dolore. L'innervazione dei follicoli piliferi in una tale preparazione è meno complesso ma la densità dei follicoli piliferi, più la presenza di tre diversi tipi follicolo (guardia, punteruolo / auchene e capelli zigzag) in tale vicinanza 6, significa studiare le risposte specifiche di un singolo follicolo o solo tipo di finale è ancora impegnativo. Inoltre, questa preparazione implica una dissezione complesso. Infine, sia vibrissal e altre preparazioni pelle, è difficile visualizzare le terminazioni coinvolti mentre la ex vivo preparativi sono ancora vivi. Così, il sezionamento del tessuto è necessario anche in linee di topi GFP che esprimono. alternativamente, richiede ulteriore elaborazione istologica / immunologica come la fissazione e / o l'incubazione anticorpo per immunofluorescenza.
Abbiamo quindi sviluppato la preparazione padiglione auricolare e lo ha utilizzato per effettuare registrazioni elettrici da una popolazione ristretta di capelli afferenze follicolo e dimostrare che la membrana ciclismo si verifica in queste terminazioni lanceolate, rappresentati da assorbimento di coloranti styryl piridinio. Infine, abbiamo dimostrato che il colorante non interferisca con sensibilità meccanica, indicando che non blocca i canali meccanotrasduzione. I risultati di semplici protocolli di stimolazione e di analisi sono illustrati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo sviluppato una relativamente semplice preparazione che possono essere rapidamente sezionato, ha bassa densità follicolo pilifero e permette stimolazione meccanica relativamente selettivo di un piccolo numero di follicoli piliferi. E 'facilmente accessibile per la registrazione elettrofisiologica e l'imaging a fluorescenza live-cellule, comprese le risposte a tingere applicazione di visualizzare i follicoli dei capelli stimolati meccanicamente, cioè i follicoli di imaging con risposte elettrofisiologiche definiti. Anche se non abbiamo fatto, questo sistema sembra anche facilmente suscettibili di sub-divisione del nervo sensitivo per singola unità (singolo assone sensoriale) registrazione e l'utilizzo mirato GFP-espressione per la visualizzazione sensoriale terminale di fine morfologia.
Abbiamo usato la preparazione della pelle dell'orecchio per studiare le caratteristiche della internalizzazione e rilascio dei fluorescente stirilici membrana pridinium coloranti 7, una tecnica originariamente sviluppato per studiare Vesic localizzataLe riciclaggio membrana nei terminali sinaptici 8. In sinapsi, l'imaging è anche facilmente combinato con registrazione elettrofisiologica simultanea di risposte nei terminali individuati 8,9. E 'stato in questi primi studi che abbiamo prima notato i coloranti sono stati internalizzati anche da terminazioni meccanosensoriali 10. Per i neuroni sensoriali nella cultura e nelle cellule ciliate cocleari, gran parte della etichettatura da coloranti styryl piridinio sembra coinvolgere i coloranti che passano attraverso i canali meccanosensoriali, che poi bloccano 11,12. I coloranti poi etichettare le membrane intracellulari, e questo l'etichettatura è irreversibile. Tuttavia, in cellule ciliate che non vengono stimolati meccanicamente 13,14 e completamente differenziate principali terminali sensoriali nervose in situ, come terminazioni Ia in fusi muscolari 15, e nelle terminazioni lanceolate qui 7, etichettatura tintura styryl sembra riflettere endocitosi membrana, dal momento che l'etichettatura è reversibile e non blocca le res meccanosensorialiponses 7,15,16. Mentre alcuni internalizzazione colorante da permeazione canale in queste terminazioni, non si può escludere del tutto, è chiaro dalla cottura continuata durante l'incubazione tintura e la reversibilità della etichettatura che la grande maggioranza della etichettatura terminali differenziati in situ è di internalizzazione con riciclo delle vescicole membrana. Così, questa semplice tecnica è facilmente utilizzato per il monitoraggio elettriche ed ottiche combinato di una serie di funzioni del terminale meccanosensoriali in ex vivo tessuti.
Come con la maggior parte delle tecniche pratiche, riproducibilità richiederà ripetizione e la pratica. Alcuni dei punti chiave particolare attenzione merita verrà ora descritta. Per tutta la sessione di dissezione e la registrazione, massimizzare la vitalità del tessuto e la sopravvivenza, garantendo la preparazione è costantemente perfuso con soluzione salina completamente saturato con il 95% O 2/5% di CO 2. Assicurarsi che i capelli follicoli non vengono spostati durante questo processo, which stimolerà sensoriale cottura finale. Utilizzare un sistema continuo flusso laminare perfusione o accuratamente gas bolla attraverso il bagno di organo con tubi raffinata ad una distanza dalla preparazione, o accuratamente aggiornare soluzioni ogni 20-30 minuti, mantenendo la preparazione di sotto della superficie salina in ogni momento. elettrodi di registrazione di aspirazione sono realizzate modificando taglienti pipette elettrodo borosilicato normalmente utilizzate per la registrazione intracellulare. In primo luogo, accuratamente rompere le punte affilate con # 3 pinze per dare il diametro interno adeguato per soddisfare i nervi e il fuoco-polacco per molto breve (1 sec <) l'esposizione a Bunsen fiamma del bruciatore (vedi 2.4 e 2.5). Per ottenere un buon rapporto segnale-rumore durante la registrazione, è essenziale che l'impedenza elettrica (resistenza) in questi due elettrodi si sia massimizzata e pari. A tale scopo, prestando attenzione a quanto segue nelle due elettrodi. Per l'elettrodo di registrazione, assicurarsi che il diametro interno è una perfetta aderenza per il nervo, e la lunghezza massima di Nerve viene aspirata l'elettrodo di registrazione. Provare a utilizzare il tessuto connettivo circostante il coraggio di sigillare in modo efficace l'elettrodo. In alternativa, o in aggiunta, disegnare l'estremità più stretta di dimensioni adeguate, piece rastremata del tessuto adiposo nel fianco del nervo. Quindi, inserire l'elettrodo applicando forte aspirazione per ~ 1 min con una siringa da 50 ml attaccato al tubo. Per una punta ben chiuso, l'applicazione di forte aspirazione semplicemente rafforzare l'efficacia della spina e non si baserà in più liquido o del nervo. Per evitare danni al sistema nervoso, tuttavia, assicurarsi che il tessuto connettivo è ammortizzazione il nervo dalla compressione sul materiale circostante e EAM cartilagine. L'elettrodo indifferente dovrebbe imitare la resistenza / impedenza dell'elettrodo di registrazione più vicino possibile. Questo è aiutato da accuratamente fuoco lucidatura della punta come piccolo un'apertura possibile, senza in realtà sigillarlo. Se è necessaria ulteriore resistenza, quindi inserire l'estremità dell'elettrodo indifferente con adipose il tessuto connettivo, come sopra descritto per l'elettrodo di registrazione.
Il electroceramic dà il controllo esclusive sui spostamento meccanico, sia spazialmente e temporalmente. Tuttavia, prendersi cura di effettuare i collegamenti elettrici – alte temperature li distruggono, in modo da non utilizzare saldatura a caldo. Utilizzare colla epossidica metallo-caricato, o utilizzare una presa specialista push-fit raccomandato dal fornitore. In questo modo sia tenerlo fermo e stabilire la connettività elettrica. Fissare la sonda vetro stimolante al electroceramic con resina epossidica standard. Fuoco-polacco alla fine di uno standard di 10 cm x 1,5 mm di diametro borosilicato tubo capillare di vetro usato per fare patch o elettrodi taglienti per la registrazione elettrofisiologica per ridurre al minimo il rischio di danni ai tessuti. Se è necessaria la stimolazione follicolo pilifero singolo, il fuoco-polacco la punta per misura un singolo capello, e posizionare la sonda con un singolo capello all'interno del diaframma aperto. Questo dà il controllo squisito su un singolo capello. Per styryl dye etichettatura, è generalmente più uniforme in tessuti di animali più giovani. Non è del tutto chiaro perché, ma questo probabilmente riflette trauma meno meccanico e più efficace rimozione dei tessuti profondi dai tessuti più giovani. Essere approfondita nella rimozione dello strato di schiuma di polistirene espanso Simile sovrastante le basi del follicolo pilifero. Tuttavia, evitare di essere troppo forte, in quanto ciò rischia di rimozione dello strato nervose del plesso e terminali lanceolate associati. Se c'è risposta elettrica poco o nessun al movimento del follicolo pilifero, ed applicazione di tintura styryl porta ad etichettatura predominante delle ghiandole sebacee (giallo / bianco), con autofluorescenza distinta della base del fusto del capello anziché terminazioni lanceolate (arancione / giallo), spazio troppo entusiasta ha danneggiato i tessuti sottostanti. Infine, utilizzando un agente colorante-chelante prima di imaging migliora notevolmente contrasto dell'immagine e la qualità delle immagini finali.
Questa tecnica può essere utile in una serie di ulteriori studi. questi coULD comprendono, ad esempio, lo screening per il canale meccanosensoriali (s) responsabile per le risposte di stiro-evocato, incubando la preparazione con ligandi farmacologici selettivi per i canali candidati o di screening linee del mouse con tali canali geneticamente cancellati. Quest'ultimo potrebbe essere combinato con la valutazione della fluorescenza di eventuali cambiamenti nella morfologia del terminale a causa della manipolazione genetica in linee del mouse, ad esempio con l'espressione GFP Npy2r-linked 17. Un ultimo esempio potrebbe essere indagare il ruolo delle vescicole sinaptiche-like (SLV) 7 in questi terminali lanceolate, esaminando l'effetto di modulatori di fatturato SLV (Ca, Mg, latrotoxin, ligandi dei recettori del glutammato) sulle risposte di stiro-evocato e tintura styryl assorbimento /uscita. Così, questa nuova tecnica apre una serie di viali potenzialmente interessanti di ricerca in neuroscienze mechansensory.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
| High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
| Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
| Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
| Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
| Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
| Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
| Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
| Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
Referencias
- Cahusac, P. M. Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle. J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (4), 300-309 (2009).
- Fagan, B. M., Cahusac, P. M. Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin. Neuroreport. 12, 341-347 (2001).
- Price, M. P., et al. The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation. Nature. 407 (6807), 1007-1011 (2000).
- Ranade, S. S., et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice. Nature. 516 (7529), 121-125 (2014).
- Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study. J. Comp. Neurol. 449 (2), 103-119 (2002).
- Li, L., Ginty, D. D. The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles. eLife. 3, 01901 (2014).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals. J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Drew, L. J., Wood, J. N. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3 (1), 1 (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Phys. Soc. 21 (PC22), (2010).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
