Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings
Summary
A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
Abstract
Eine neuartige Dissektion und Aufzeichnungstechnik wird zur Überwachung afferenten Brennens durch mechanische Verschiebung der Haare in der Maus Ohrmuschel evozierten beschrieben. Die Technik ist sehr kostengünstig und einfach mit Materialien, die üblicherweise in den meisten Elektro Laboratorien oder leicht gekauft fand geführt. Die Präparation ist einfach und schnell, mit der mechanischen durch eine generische elektrokeramischer Wafer durch proprietäre Software gesteuert bereitgestellt Verschiebung. Die gleiche Software auch Aufzeichnungen und analysiert die electroneurogram ausgegeben. Die Aufzeichnung der Aktivität hervorgerufenen Nerven ist über einen kommerziellen Differenzverstärker zu feuerpolierten Standardglas-Mikroelektroden verbunden. Hilfreiche Tipps für die Verbesserung der Qualität der Zubereitung, die Stimulation und die Aufnahmebedingungen gegeben Aufnahmequalität zu optimieren. Das System eignet sich zur Bestimmung der elektrophysiologischen und optischen Eigenschaften von lanceolate Anschlüsse der Palisadendigungen der Haarfollikel sowie dieErgebnisse aus ihrer pharmakologischen und / oder genetische Manipulation. Ein Beispiel für die Kombination von elektrischen Aufzeichnung mit mechanischer Stimulation und Markierung mit einem Styrylpyridinium- Vitalfarbstoff gegeben.
Introduction
Die lanceolate Terminals sensorischer Axone Innervation Haarfollikeln bei Säugetieren Palisaden bilden um das Haar-Welle Epithel. Ihr Zweck ist, mechanische Verschiebung der Haare zu erkennen, sie umgeben. Sie sind eine Mischung aus schnell und langsam Endungen Anpassung, die überwiegend kurze Ausbrüche von Aktivität in Reaktion auf Haar Bewegung erzeugen. Aktivität aufhört sehr schnell, wenn die Bewegung stoppt, sogar in Gegenwart von fort Verschiebung. Hier beschreiben wir die Entwicklung dieses murine Ohrmuschel Modell für Korrelat Studien von Struktur und Funktion in lanceolate Terminals. Die Ohrmuschel hat viele vorteilhafte Eigenschaften für diese Endungen zu studieren. Erstens ist die Ohrmuschel im wesentlichen zwei Schichten der Haut angelagert back-to-back, mit wenig anderes Gewebe zwischen den Zugang zu den Follikeln und die Anschlüsse zu stören. Die Haut ist sehr dünn und leicht durch minimale Mengen an harten Bindegewebe seziert. Die Innervation ist leicht zugänglich und erkennbar. Während Haar follicles vorhanden sind, sind sie relativ dünn verteilt, mechanisch die Stimulation der einzelne oder kleine Gruppen von Follikeln zu erleichtern. Die dünne darunter liegende Hautschicht ergibt eine gute Zugänglichkeit zu den Nervenendigungen mit pharmakologischen Medikamenten und Farbstoffen. Das macht sie besonders geeignet für die Bildgebung Studien unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Die Bildgebung kann entweder in lebenden Terminals sein, oder nach der Fixierung und weitere histologische Verarbeitung.
Die Antworten von mechanosensorischen Neuronen Innervation Haarfollikeln traditionell vibrissae 1,2 und in geringerem Ausmaß, in isolierten Hautpräparate 3,4 in Nagetieren untersucht worden. Diese haben uns gelehrt, viel über die allgemeinen Grundsätze der mechanosensorischen Physiologie in den Nervenendigungen in den Haarschaft umgibt. Die vibrissal Vorbereitung ermöglicht exquisite Kontrolle über die Bewegung eines einzelnen Haarfollikel. Jedoch kann es schwierig sein, die Ausgabe aufgrund seiner Komplexität zu entschlüsseln, wie vibrissalFollikel enthalten mindestens 8 verschiedene Arten von anatomisch verschiedene mechanosensorischen Ende 5 und die Abstimmung dieser morphologischen Typen auf bestimmte elektrophysiologischen Reaktionen ist nach wie vor umstritten. Die Mäusehaut / saphenus Vorbereitung wird am häufigsten in seiner enthaarte Zustand verwendet Antworten Berührung und Schmerz zu untersuchen. Die Innervation der Haarfollikel in einem solchen Präparat ist weniger komplex , aber die Dichte der Haarfollikel, sowie das Vorhandensein von drei verschiedenen Follikel – Typen (Wache, Ahle / auchene und Zick – Zack – Haare) in solcher Nähe 6, bedeutet , dass die spezifischen Antworten des Studiums ein einzelner Follikel oder einzelne Art von Ende herausfordernd wieder. Darüber hinaus beinhaltet diese Vorbereitung eine komplexe Präparation. Schließlich Zubereitungen in sowohl vibrissal und andere Haut, ist es schwierig , die Enden , während der ex vivo Präparationen noch am Leben sind beteiligt zu visualisieren. Somit wird Gewebe Schnitte auch in GFP-exprimierenden Mauslinien erforderlich. Alternavely erfordert es weitere histologische / immunologischen Verarbeitung, wie die Fixierung und / oder Antikörper-Inkubation für Immunofluoreszenz.
Wir haben daher die Ohrmuschel Vorbereitung und dem verwendeten elektrischen Aufnahmen von einer eingeschränkten Population von Haarfollikel Afferenzen zu machen und zeigen, dass Membran Radfahren in diesen lanceolate Endungen auftritt, belegt durch die Aufnahme von Styrylpyridinium- Farbstoffe. Schließlich haben wir gezeigt, dass der Farbstoff nicht mit mechanischen Empfindlichkeit nicht beeinträchtigt, was anzeigt, es nicht die Mechanotransduktion Kanäle nicht blockiert. Die Ergebnisse der einfachen Stimulation und Analyseprotokolle dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir eine relativ einfache Herstellung entwickelt, die schnell zerlegt werden kann, hat eine geringe Dichte und Haarfollikel ermöglicht relativ selektive mechanische Stimulation einer kleinen Anzahl von Haarfollikeln. Es ist leicht zugänglich für elektrophysiologische Aufzeichnung und Live-Zell – Fluoreszenz – Bildgebung, einschließlich der Antworten Anwendung zu färben die mechanisch stimuliert Haarfollikel, dh Bildgebung Follikel mit definierten elektrophysiologischen Reaktionen sichtbar zu machen. Während wir noch nicht getan haben, scheint dieses System auch leicht zugänglich, um die sensorischen Nerven für einzelne Einheit (Einzel sensorischen Axon) Aufnahme Unterteilung und gezielte GFP-Expression unter Verwendung von für die Visualisierung sensorischer Terminal endet Morphologie.
Wir haben die Ohrhautpräparat 7 verwendet die Eigenschaften der Internalisierung und Freisetzung der fluoreszierenden Membran styryl pridinium Farbstoffe zu untersuchen, eine Technik , die ursprünglich zu studieren lokalisierten Vesic entwickeltle Membran – Recycling in der synaptischen Terminals 8. In Synapsen wird Bildgebung auch bei gleichzeitiger Aufnahme von elektrophysiologischen Reaktionen in identifizierten Terminals 8,9 leicht kombiniert. Es war in diesen frühen Studien , die wir zum ersten Mal die Farbstoffe auch durch mechanosensorischen Endungen 10 internalisiert festgestellt wurden. Für sensorische Neuronen in Kultur und in Cochlea Haarzellen, viel von der Markierung durch Styryl pyridinium Farbstoffe scheint Farbstoffe , die durch die mechanosensorischen Kanäle beinhalten, die sie dann 11,12 blockieren. Die Farbstoffe beschriften dann intrazellulären Membranen, und diese Kennzeichnung ist irreversibel. In Haarzellen jedoch , die nicht mechanisch 13,14 stimuliert werden und in ausdifferenzierten primären sensorischen Nervenendigungen in situ, beispielsweise Ia Digungen in Muskelspindeln 15 und in den lanceolate Digungen hier 7 scheint Styrylfarbstoff Kennzeichnungs Membran Endozytose zu reflektieren, da die Kennzeichnung ist reversibel und blockiert nicht die mechanosensorischen responses 7,15,16. Während einige Farbstoff Internalisierung durch Kanal Permeation in diesen Endungen nicht vollständig ausgeschlossen werden kann, ist es von der weiterhin Brennen während der Farbstoff Inkubation und die Reversibilität der Kennzeichnung deutlich , dass die große Mehrheit der Etikettierung in differenzierten Terminals in situ durch Internalisierung mit Recycling – Vesikel Membran. Somit ist diese einfache Technik für den kombinierten elektrischen und optischen Überwachung einer Reihe von mechanosensorischen Terminalfunktionen in ex vivo Gewebe ohne weiteres eingesetzt.
Wie bei den meisten praktischen Techniken, Reproduzierbarkeit Wiederholung und Übung erfordern. Einige der wichtigsten Punkte wert besondere Aufmerksamkeit wird nun beschrieben. Während der Präparation und Aufnahme – Session, maximieren die Lebensfähigkeit des Gewebes und das Überleben durch die Vorbereitung zu gewährleisten ständig mit Kochsalzlösung durchströmt wird , vollständig mit 95% O 2/5% CO 2 gesättigt. Sicherstellen, dass die Haarfollikel nicht während dieses Prozesses verschoben, which will sensorischen Ende Brennen stimulieren. Verwenden Sie entweder eine kontinuierliche, Laminar-Flow-Perfusions-System oder sorgfältig Blase Gas durch das Organbad mit feinen Schlauch in einem Abstand von der Vorbereitung, oder sorgfältig aktualisieren Lösungen für jeden 20-30 Minuten, zu jeder Zeit die Vorbereitung unter der Salzoberfläche zu halten. Absaug- Aufzeichnungselektroden werden durch Modifizieren scharfe Elektrode Borosilikat-Pipetten normalerweise für die intrazelluläre Aufnahme verwendet gemacht. Zuerst sorgfältig die scharfen Spitzen mit # 3 Zange abbrechen die entsprechende Innendurchmesser zu geben, die Nerven und Feuerpolitur durch sehr kurze (<1 sec) Exposition gegenüber Bunsenbrennerflamme zu passen (siehe 2.4 und 2.5). Um ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis erhalten, wenn die Aufzeichnung, ist es wesentlich, dass die elektrische Impedanz (Widerstand) in diesen beiden Elektroden sowohl maximiert und gleich. Tun Sie dies, indem die Aufmerksamkeit auf die folgenden in den beiden Elektroden. Für die Aufzeichnungselektrode, sicherzustellen, der Innendurchmesser eine eng anliegende Passform für die Nerven ist, und die maximale Länge neRVE wird in die Aufzeichnungselektrode gezogen. Versuchen Sie, das Bindegewebe rund um die Nerven zu verwenden, um effektiv die Elektrodenspitze abzudichten. Alternativ oder zusätzlich zeichnen das schmale Ende eines geeigneter Größe, verjüngte Stück Fettgewebe in neben dem Nerv. Dann stecken Sie die Elektrodenspitze durch Anlegen starken Sog für ~ 1 min mit einer 50-ml-Spritze mit dem Rohr befestigt. Für eine gut abgedichtete Spitze wird stark abgesaugt wird einfach die Wirksamkeit des Steckers zu stärken und wird nicht mehr flüssig oder Nerv ziehen in. Um Nervenschäden zu vermeiden, sollten Sie jedoch, dass das Bindegewebe den Nerv von Kompression auf das umgebende Material und EAM Knorpel abzufedern. Die indifferente Elektrode sollte der Widerstand / Impedanz der Aufzeichnungselektrode so dicht wie möglich nachahmen. Dies geschieht durch vorsichtiges Feuerpolieren der Spitze so klein eine Öffnung wie möglich geholfen, ohne es wirklich abdichten. Wenn weitere Widerstand erforderlich ist, dann stecken Sie das Ende der indifferenten Elektrode mit adipose Bindegewebe, wie oben für die Aufzeichnungselektrode beschrieben.
Die elektrokeramischer gibt exquisite Kontrolle über mechanische Verschiebung, sowohl räumlich als auch zeitlich. Achten Sie jedoch darauf elektrische Verbindungen herstellen – hohe Temperaturen zerstören sie, also nicht Lötzinn verwenden. Verwenden Sie mit Metall beladene Epoxy-Kleber, oder verwenden Sie einen Fachsteckmuffe vom Lieferanten empfohlen. Dadurch wird es sowohl fest halten und die elektrische Verbindung herzustellen. Bringen Sie das Glas anregende Sonde an die elektrokeramischer mit Standard-Epoxidharz. Feuer-Politur das Ende eines Standard-10 cm x 1,5 mm Durchmesser Borosilikat Glaskapillarröhren zur Herstellung von Patch oder scharfe Elektroden für elektrophysiologische Aufzeichnung verwendet, um das Risiko von Gewebeschäden zu minimieren. Wenn einzelne Haarfollikel Stimulation erforderlich ist, Feuerpolitur der Spitze ein einzelnes Haar zu passen, und die Sonde mit einem einzigen Haar in die offene Öffnung positionieren. Dies gibt exquisite Kontrolle über ein einzelnes Haar. Für Styryl dye Etikettierung ist es im Allgemeinen gleichmäßigere in Geweben von jungen Tieren. Es ist nicht ganz klar, warum, aber dies spiegelt wahrscheinlich weniger mechanische Trauma und effektiver tiefe Gewebeentnahme aus den jüngeren Geweben. Seien Sie gründlich in die schaumige Schicht ähnelnden expandiertem Polystyrol Entfernen der Haarfollikel Basen liegt. Vermeiden Sie jedoch zu stark sein, da dies die Nervengeflechte Schicht und die damit verbundenen lanceolate Terminals Risiken zu entfernen. Wenn es wenig oder keine elektrische Antwort auf Haarfollikel Bewegung ist, und Styrylfarbstoff Anwendung führt zur überwiegenden Kennzeichnung Talgdrüsen (gelb / weiß), mit ausgeprägtem Eigenfluoreszenz der Basis des Haarschaftes anstatt lanceolate Digungen (orange / gelb), überenthusiastische Clearance hat die darunter liegende Gewebe beschädigt. Schließlich stark ein Farbstoff-Chelatbildner vor Bildgebung verbessert den Bildkontrast und die Qualität der endgültigen Bilder.
Diese Technik könnte in einer Reihe von weiteren Studien nützlich sein. Diese Could umfassen zum Beispiel für den mechanosensorischen Kanal-Screening (n) verantwortlich für die Strecke hervorgerufenen Reaktionen, durch die Zubereitung mit pharmakologischen Liganden selektiv für Kandidatenkanälen Inkubation oder Screening-Mauslinien mit solchen Kanälen genetisch gelöscht. Letzteres könnte mit Fluoreszenz Beurteilung von Änderungen in Terminal Morphologie kombiniert werden durch genetische Manipulation in Mauslinien, zB mit Npy2r gebundenen GFP – Expression 17. Ein letztes Beispiel kann die Rolle der synaptic-like Vesikel (SLVs) 7 in diesen lanceolate Terminals Untersuchung durch die Wirkung von Modulatoren der SLV Umsatz untersucht (Ca, Mg, Latrotoxin, Glutamat – Rezeptor – Liganden) auf Dehnung hervorgerufenen Reaktionen und styryl Farbstoffaufnahme /Freisetzung. Somit eröffnet diese neue Technik eine Reihe von potentiell interessante Wege in der Forschung in den Neurowissenschaften mechansensory auf.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
| High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
| Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
| Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
| Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
| Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
| Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
| Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
| Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
Referencias
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