المشتركة تسجيل من ميكانيكيا بتنشيط وارد الناتج والأعصاب الطرفية وسمها في ماوس الشعر المسام سناني الشكل النهايات
Summary
A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
Abstract
يوصف تشريح والتسجيل تقنية جديدة لاطلاق الرصد وارد أثار من النزوح الميكانيكية من الشعر في الصيوان الماوس. هذه التقنية هي جدا فعالة من حيث التكلفة والتي اتخذت بسهولة مع المواد التي توجد عادة في معظم المختبرات الكهربية، أو بسهولة شراؤها. تشريح بسيط وسريع، مع تشريد الميكانيكية التي تقدمها رقاقة electroceramic عام تسيطر عليها البرمجيات الاحتكارية. البرنامج نفسه أيضا سجلات ويحلل الناتج electroneurogram. تسجيل النشاط العصبي أثار البرنامج هو عبارة عن مكبر للصوت التفاضلية التجاري متصلة الميكروية الزجاج القياسية مصقول النار. يتم إعطاء نصائح مفيدة لتحسين نوعية إعداد وتحفيز وشروط تسجيل لتحسين جودة التسجيل. هذا النظام هو مناسبة لمعايرة الخصائص الكهربية والضوئية محطات سناني الشكل من النهايات سياجية من بصيلات الشعر، وكذلكالنتائج من التلاعب بهم الدوائي و / أو وراثي. تم اعطاء مثال الجمع بين تسجيل الكهربائية مع التحفيز الميكانيكي ووضع العلامات مع صبغة حيوية styryl البيريدينيوم.
Introduction
محطات سناني الشكل من المحاور الحسية التعصيب بصيلات الشعر في الثدييات تشكل الحواجز حول ظهارة الشعر رمح. الغرض منها هو الكشف عن تشريد الميكانيكية من الشعر يحيطون. فهي مزيج من بسرعة وببطء التكيف مع النهايات التي تنتج في الغالب رشقات نارية قصيرة من النشاط في الاستجابة لحركة الشعر. آخر يتوقف بسرعة كبيرة عندما تتوقف الحركة، حتى في وجود استمر النزوح. نحن هنا وصف تطوير هذا النموذج الصيوان الفئران للدراسات الملازمة للهيكل وتعمل في محطات سناني الشكل. الصيوان ديها العديد من الميزات مفيدة لدراسة هذه النهايات. أولا، الصيوان هو أساسا طبقتين من الجلد الرئيسي يعارضها-العودة إلى الوراء، مع الأنسجة الأخرى قليلا بين التدخل في الوصول إلى بصيلات والمحطات. الجلد رقيقة جدا وتشريح بسهولة نظرا لكميات ضئيلة من النسيج الضام صعبة. تعصيب يمكن الوصول إليه بسهولة والتعرف. في حين follicl الشعروفاق موجودة، فإنها توزع قليلة نسبيا، وتسهيل وتحفيز الأفراد أو الجماعات الصغيرة من بصيلات ميكانيكيا. طبقة الجلد الأساسية رقيقة يعطي الوصول جيدة للمحطات العصبية مع العقاقير الدوائية والأصباغ. هذا يجعلها مثالية بشكل خاص للدراسات التصوير باستخدام المجهر مضان. يمكن أن يكون التصوير سواء في محطات الحية أو بعد تثبيت ومزيد من المعالجة النسيجي.
ردود الخلايا العصبية ميكانيكية حسية التعصيب تقليديا درس بصيلات الشعر في القوارض vibrissae 1،2، وإلى حد أقل، في المستحضرات الجلدية معزولة 3،4. قد علمت هؤلاء لنا الكثير عن المبادئ العامة للعلم وظائف الأعضاء ميكانيكية حسية في النهايات العصبية المحيطة جذع الشعرة. إعداد vibrissal يسمح مراقبة رائعة على حركة جريب شعرة واحدة. ومع ذلك، فإنه يمكن أن يكون من الصعب فك إخراج المقرر أن تعقيدها، كما vibrissalبصيلات تحتوي على ما لا يقل عن 8 أنواع مختلفة من نهاية ميكانيكية حسية مميزة تشريحيا (5) ومطابقة هذه الأنواع المورفولوجية لردود الكهربية محددة لا يزال موضع خلاف. وغالبا ما يستخدم / إعداد العصب الصافن الجلد الماوس في حالته نزعه للتحقيق استجابات اللمس والألم. تعصيب من بصيلات الشعر في مثل هذا التحضير هو أقل تعقيدا ولكن كثافة من بصيلات الشعر، بالإضافة إلى وجود ثلاثة أنواع الجريب مختلفة (حارس، الخرامه / auchene والشعر متعرجة) في مقربة من هذا القبيل 6، يعني دراسة استجابات محددة من جريب واحد أو نوع واحد من انتهاء يمثل تحديا مرة أخرى. وعلاوة على ذلك، وهذا ينطوي على إعداد تشريح المعقد. وأخيرا، في كل من vibrissal وغيرها من المستحضرات الجلدية، فإنه من الصعب تصور النهايات يشارك في حين أن المجراة سابقا الاستعدادات لا تزال على قيد الحياة. وبالتالي، لا بد باجتزاء الأنسجة حتى في خطوط الماوس، معربا عن GFP. Alternatively، فإنه يتطلب مزيدا من النسيجي / المناعية معالجة مثل تثبيت و / أو حضانة الأجسام المضادة للالمناعي.
لذا قمنا بتطوير إعداد الصيوان واستخدامها لجعل التسجيلات الكهربائية من عدد محدود من الأفراد من afferents بصيلات الشعر وتبين أن غشاء الدراجات يحدث في هذه النهايات سناني الشكل، يتضح من الإقبال على الأصباغ styryl البيريدينيوم. وأخيرا، أظهرنا أن الصبغة لا تتداخل مع حساسية الميكانيكية، مشيرا إلى أنه لا يمنع القنوات mechanotransduction. ويوضح نتائج التحفيز وتحليل بروتوكولات بسيطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، قمنا بتطوير إعداد بسيط نسبيا التي يمكن تشريح بسرعة، لديها منخفض الكثافة بصيلات الشعر وتسمح التحفيز الميكانيكي انتقائية نسبيا من عدد قليل من بصيلات الشعر. ويمكن الوصول إليها بسهولة لتسجيل الكهربية والخلية الحية التصوير الفلورسنت، بما في ذلك الاستجابة لصبغ تطبيق لتصور بصيلات الشعر حفز ميكانيكيا، أي بصيلات التصوير مع ردود الكهربية محددة. في حين أننا لم نفعل ذلك، كما يبدو أن هذا النظام قابلة بسهولة لشبه-تقسيم العصب الحسي من أجل وحدة واحدة (واحد عصبي حسي) تسجيل واستخدام المستهدفة GFP في التعبير عن تصور الحسي محطة إنهاء التشكل.
وقد استخدمنا إعداد الجلد الأذن للتحقيق في خصائص استيعاب والافراج عن فلوري غشاء styryl الأصباغ pridinium 7، وهي تقنية طورت في الأصل لدراسة vesic المحليةلو تدوير الغشاء في محطات متشابك 8. في نقاط الاشتباك العصبي، وكذلك الجمع بين التصوير بسهولة مع تسجيل الكهربية في وقت واحد من الردود في المحطات التي تم تحديدها 8،9. وكان في هذه الدراسات المبكرة التي لاحظنا أولا الأصباغ والمنضوية أيضا النهايات ميكانيكية حسية 10. لالخلايا العصبية الحسية في الثقافة وفي خلايا الشعر القوقعة، فإن الكثير من العلامات التي الأصباغ styryl البيريدينيوم يبدو لإشراك الأصباغ التي تمر عبر قنوات ميكانيكية حسية، والتي ثم منع 11،12. ثم تسمية الأصباغ أغشية الخلايا، وهذه العلامات لا رجعة فيه. ومع ذلك، في خلايا الشعر التي لا تحفز ميكانيكيا 13،14 وفي محطات متباينة تماما الأولية الحسية العصبية في الموقع، مثل النهايات الأول (أ) في مغزل العضلات 15، والنهايات سناني الشكل هنا 7، styryl صبغ العلامات يبدو أن تعكس غشاء الإلتقام، منذ الوسم هو عكسها ولا يمنع الدقة ميكانيكية حسيةponses 7،15،16. في حين أن بعض استيعاب صبغ من قبل تخلل قناة في هذه النهايات لا يمكن استبعاده تماما، فمن الواضح من استمرار إطلاق خلال حضانة صبغ والعودة إلى الوراء من وضع العلامات على أن الغالبية العظمى من وضع العلامات في محطات متباينة في الموقع هي من خلال استيعاب مع حويصلة إعادة التدوير غشاء. وبالتالي، يتم استخدام هذه التقنية بسيطة بسهولة لرصد الكهربائية والبصرية المشترك لمجموعة من الوظائف محطة ميكانيكية حسية في أنسجة خارج الحي.
كما هو الحال مع معظم التقنيات العملية، واستنساخ تتطلب التكرار والممارسة. والآن وصفها بعض النقاط الرئيسية اهتماما خاصا يستحق. طوال الدورة تشريح والتسجيل، وتعظيم الجدوى الأنسجة والبقاء على قيد الحياة من خلال ضمان إعداد وperfused باستمرار مع المياه المالحة مشبعة تماما مع 95٪ O 2/5٪ CO 2. ضمان الشعر لا نزوح بصيلات خلال هذه العملية، ذوي الخوذات البيضاءالتراث الثقافي غير المادي سوف تحفز اطلاق إنهاء الحسي. إما استخدام، وتدفق الصفحي نظام مستمر نضح، أو بعناية الغاز فقاعة من خلال حمام الجهاز مع أنابيب غرامة على مسافة من إعداد أو تحديث بعناية حلول كل 20-30 دقيقة، والحفاظ على إعداد تحت سطح المياه المالحة في جميع الأوقات. مصنوعة أقطاب تسجيل الشفط عن طريق تعديل الحادة ماصات القطب البورسليكات تستخدم عادة لتسجيل داخل الخلايا. أولا، كسر بعناية من النصائح حادة مع # 3 ملقط لإعطاء القطر الداخلي المناسب لتناسب الأعصاب والنار البولندية من قبل وجيزة جدا (<1 ثانية) التعرض لبنسن لهب الموقد (انظر 2.4 و 2.5). للحصول على جيدة نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند التسجيل، فمن الضروري أن معاوقة (المقاومة) في هذه القطبين إلى أقصى حد ممكن وعلى قدم المساواة على حد سواء. القيام بذلك عن طريق الالتفات الى ما يلي في القطبين. لالقطب تسجيل، وضمان قطرها الداخلي هو نوبة دافئ للعصب، والحد الأقصى لطول شمال شرقويوجه RVE في القطب تسجيل. محاولة استخدام الأنسجة الضامة المحيطة العصب لختم فعال طرف القطب. بدلا من ذلك، أو بالإضافة إلى ذلك، رسم نهاية الضيقة ل، قطعة مدبب الحجم مناسب من الأنسجة الدهنية في جنبا إلى جنب مع العصب. ثم قم بتوصيل الطرف الكهربائي من خلال تطبيق شفط قوي ل~ 1 دقيقة مع حقنة 50 مل تعلق على الأنابيب. لمعلومات سرية مختومة جيدا، وتطبيق شفط قوي بكل بساطة تعزيز فعالية التوصيل ولن جذب أكثر سيولة أو العصبية. لتجنب تلف الأعصاب، ومع ذلك، تأكد من أن النسيج الضام ويخفف حدة العصبية من الضغط على المواد المحيطة بها وزير الشئون الخارجية الغضروف. القطب غير مبال يجب أن تحاكي المقاومة / مقاومة من القطب تسجيل بأكبر قدر ممكن. ويساعد على ذلك بعناية النار تلميع طرف إلى صغيرة فتحة ممكن من دون ختم فعلا. اذا كانت هناك حاجة مزيد من المقاومة، ثم قم بتوصيل نهاية القطب غير مبال مع adipoحد ذاته النسيج الضام، كما هو موضح أعلاه لالقطب تسجيل.
وelectroceramic يعطي السيطرة رائعة مطلة على النزوح الميكانيكية، مكانيا وزمانيا. ومع ذلك، ورعاية إجراء التوصيلات الكهربائية – ارتفاع درجات الحرارة تدميرها، حتى لا تستخدم لحام الساخن. استخدام محملة المعادن الايبوكسي الغراء، أو استخدام مأخذ توافق بالضغط متخصص الموصى بها من قبل المورد. وهذا على حد سواء لأنه عقد بحزم وإقامة الربط الكهربائي. إرفاق التحقيق الزجاج محفزة للelectroceramic مع راتنجات الايبوكسي القياسية. النار تلميع نهاية القياسية 10 سم × 1.5 مم البورسليكات أنابيب الزجاج الشعرية التي تستخدم في صنع التصحيح أو الأقطاب حادة لتسجيل الكهربية للحد من خطر تلف الأنسجة. إذا كنت بحاجة تحفيز بصيلات الشعر واحد، والحرائق تلميع طرف لتناسب شعرة واحدة، وموقف التحقيق مع شعرة واحدة داخل الفتحة مفتوحة. هذا يعطي السيطرة رائعة مطلة على شعرة واحدة. لدى styrylه وضع العلامات، هو أكثر عموما موحدة في الأنسجة من الحيوانات الأصغر سنا. وليس من الواضح تماما لماذا، ولكن هذا من المرجح يعكس جروحا أقل الميكانيكية وإزالة أكثر فعالية الأنسجة العميقة من الأنسجة الأصغر سنا. كن دقيقا في إزالة طبقة رغوي تشبه إلى البوليسترين الموسع تغمر قواعد بصيلات الشعر. ومع ذلك، تجنب قوية جدا، وهذا يهدد إزالة طبقة الضفيرة العصبية ومحطات سناني الشكل المرتبطة بها. إذا كان هناك القليل أو أي رد الكهربائية لحركة بصيلات الشعر، وتطبيق styryl صبغ يؤدي إلى وضع العلامات الغالب من الغدد الدهنية (أصفر / أبيض)، مع تألق ذاتي واضح في قاعدة عمود الشعر بدلا من النهايات سناني الشكل (برتقالي / أصفر)، إزالة الإفراط في الحماس وتلف الأنسجة الكامنة. وأخيرا، وذلك باستخدام وكيل صبغ مخلبية قبل التصوير يحسن إلى حد كبير على النقيض من الصورة وجودة الصور النهائية.
هذه التقنية يمكن أن تكون مفيدة في مجموعة واسعة من إجراء المزيد من الدراسات. هذه المشاركتشمل يونيتبول، على سبيل المثال، وفحص للقناة ميكانيكية حسية (ق) المسؤولة عن الاستجابات أثار تمتد، التي يحتضنها إعداد مع بروابط الدوائية انتقائية للقنوات مرشح أو فحص خطوط الفأر مع هذه القنوات المحذوفة وراثيا. وهذه الأخيرة يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع تقييم مضان من أي تغييرات في التشكل المحطة بسبب التلاعب الجيني في خطوط الماوس، على سبيل المثال مع مرتبطة Npy2r التعبير GFP 17. قد يكون هناك مثال أخير التحقيق في دور الحويصلات مثل متشابك (يتعامل هؤلاء الموردون) 7 في هذه المحطات سناني الشكل من خلال دراسة تأثير جهري من دوران السلفادور (الكالسيوم، والمغنيسيوم، latrotoxin، بروابط مستقبلات الغلوتامات) على استجابات أثار تمدد الجلد وامتصاص styryl صبغ /إطلاق سراح. وهكذا، هذه التقنية الجديدة تفتح مجموعة من السبل المحتملة للاهتمام من الأبحاث في علم الأعصاب mechansensory.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
| High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
| Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
| Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
| Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
| Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
| Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
| Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
| Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
Referencias
- Cahusac, P. M. Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle. J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (4), 300-309 (2009).
- Fagan, B. M., Cahusac, P. M. Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin. Neuroreport. 12, 341-347 (2001).
- Price, M. P., et al. The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation. Nature. 407 (6807), 1007-1011 (2000).
- Ranade, S. S., et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice. Nature. 516 (7529), 121-125 (2014).
- Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study. J. Comp. Neurol. 449 (2), 103-119 (2002).
- Li, L., Ginty, D. D. The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles. eLife. 3, 01901 (2014).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals. J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Drew, L. J., Wood, J. N. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3 (1), 1 (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Phys. Soc. 21 (PC22), (2010).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
