מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי

הסינתזה של חלבון היא תהליך האנרגיה הרב ביותר בתאים ^1,2. לפיכך, אין זה מפתיע כי שכיחותם חלבון נשלטת בעיקר על translational ולא ^3,4,5 רמת התעתיק. Polysome הוא המרכיב macromolecular היסוד הממיר את המידע mRNA לתוך readouts חלבוניים פונקציונלי. Polysomes ובכך מוכרים ככל מתחמי macromolecular שבו מספר פקדים translational להתכנס ^6-13. למרות מאה מחקרים על מבנה הריבוזום ^{14- 16,} תובנה המולקולריות המפורטות לתוך הדינמיקה של תרגום ואת הטופולוגיה של polysomes נתקלו עניין מוגבל. כתוצאה מכך, הארגון של מתחם polysomal ribonucleoprotein יליד ההשפעה הפוטנציאלית שלה על תרגום עדיין די בעיות מעורפלות. Polysomes עשוי להסתיר עדיין ארגונים ידועים הורה ופונקציונלי, פוטנציאל שיקוף נוקלאוזום מה לניהול עבודות אפיגנטייםls ייצג לתחום שעתוק. ואכן, החקירה של שערת מסקרן זה דורשת מחקרים נוספים וגישות טכניות חדשות. בקו הזה, טכניקות מבניות במיקרוסקופ כוח אטומי יכולים לשתף פעולה פורה לפענח מנגנונים חדשים לבקרת ביטוי גנים, בדומה למה הושג עבור הנוקלאוזום ^17,18.

מאז גילויו של הריבוזום ^14-16, מבנו התאפיין בהרחבת פרוקריוטים ^19,20, שמרים ²¹ ולאחרונה ב ^-22 אנושיים, מתן התיאור המולקולרי של המנגנונים בבסיס סינתזת חלבון. Polysomes בתחילה הוכרו על הממברנה של reticulum endoplasmic, ויצר ארגונים גיאומטריים 2D טיפוסיים ^14. כפי שהוזכר קודם לכן, הרכבת polysome לא מושא ריבית קבועה כמו המבנה הריבוזום. בעבר, polysomes נחקר בעיקרו על ידי transmission EM מבוסס טכניקות. רק לאחרונה, טכניקות קריו-EM איפשר שחזור 3D של polysomes מטוהרים ממערכות תרגום במבחנה ^23-26, lysates הסלולר אדם ²⁷ או בתאים ^28. טכניקות אלו המוצעים מידע מעודן יותר על הארגון הריבוזום-הריבוזום ב polysomes ^{23, 26-28} ותיאור מולקולרי ראשוני של משטחי מגע של ריבוזומים סמוכים polysomes נבט חיטה ^24. לפיכך, טומוגרפיה קריו-EM מאפשרת הגילוי של אינטראקציות הריבוזום-הריבוזום עם מולקולרי, אבל הוא נטל על ידי ושחזור שלאחר עיבוד נרחב מנתח הדורשים משאבי חישוביים כבדים לצורך הטיפול במידע. יתר על כן, כדי לקבל את הפרטים המולקולריים של אינטראקציות הריבוזום-הריבוזום, מפה נפתרה ביותר של הריבוזום נדרשה, וגם זה סוג של הריבוזום עזר זמין רק לכמה מינים. חשוב לציין, טומוגרפיה קריו-EM היא לא מסוגלת לזהות RNA בחינם. Therefבצר, טכניקות חדשות נדרשים להבין את הארגון באופן מלא של מכונות תרגום.

לצד קריו-EM, AFM הועסק גם ככלי שימושי עבור הדמיה ישירה של polysomes אאוקריוטים התחתון ^29-33 ובני אדם ^27. לעומת EM, AFM לא דורש קיבוע מדגם או תיוג. בנוסף, מדידות יכולות להתבצע בתנאים פיסיולוגיים ליד ועם האפשרות הייחודית של זיהוי הוא ריבוזומים בבהירות גדילי RNA עירום ^27. הדמיה של polysomes היחיד יכולה להתבצע במהירות יחסית, קבלת אלף תמונות בבת ברזולוצית ננו עם מאמץ שלאחר עיבוד מעט לעומת העיבוד שלאחר נרחב וכבד ושחזור ניתוחי נדרש על ידי מיקרוסקופ קריו-EM. כתוצאה מכך, AFM טיפול נתונים וניתוח לא צריך תחנות עבודה יקרות וכוח מחשוב גבוה. ככזה, טכניקה זו אוספת מידע על צורות polysomal, מאפיינים מורפולוגיים (כגוןגובה, אורך ורוחב), צפיפויות הריבוזום, בנוכחות RNA חינם ומספר ריבוזומים לכל polysome ²⁷ עם תפוקה גבוהה יותר מאשר-EM קריו. באופן כזה, AFM מייצג גישה חזק משלים טכניקות EM להציג polysomes ^27.

כאן אנו מציגים צינור מלא מפני טיהור כדי ניתוח נתונים שבו AFM מוחל תמונה ולנתח polysomes במוח עכבר. הפרוטוקול המוצע מתמקד בנושאי טיהור ועל בתצהיר המדויק של polysomes על מצעים יציצו המשמשים הדמית AFM. בנוסף ניתוח חלקיקים קונבנציונלי שניתן לבצע בקלות עם תוכנה נפוצה בשימוש על ידי קהילת AFM, תוסף ³⁴ ImageJ, שנקרא RiboPick, מוצג עבור לספור את מספר ריבוזומים לכל polysome ^{27, 35.}