An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.
Todos los procedimientos de secuenciación de próxima generación (NGS) incluyen ensayos realizados en el banco de laboratorio ( "banco húmedo") y los datos de los análisis realizados en el uso de la bioinformática tuberías ( "banco seco"). Ambos elementos son esenciales para producir resultados precisos y fiables, que son especialmente críticos para los laboratorios clínicos. tecnologías NGS dirigidos, han encontrado cada vez más a favor de las aplicaciones de oncología para ayudar a los objetivos de la medicina de precisión de avance, sin embargo, a menudo los métodos implican desconectado y variable de los flujos de trabajo de banco húmeda y seca y juegos de reactivos no coordinadas. En este informe, se describe un método para la secuenciación de muestras de cáncer de desafiar con un panel de 21 genes como un ejemplo de un sistema integral orientado NGS. El sistema integra la cuantificación de ADN funcional y calificación, de un solo tubo de multiplexado de enriquecimiento PCR, y la purificación de la biblioteca y la normalización utilizando verificadas analíticamente, reactivos de una sola fuente con una suite bioinformática independientes.Como resultado, la variante exacta llamadas de baja calidad y fijado en formalina baja cantidad, incluido en parafina (FFPE) y la aspiración con aguja fina (FNA) biopsias tumorales pueden ser alcanzados. El método se puede evaluar de manera rutinaria variantes asociadas con el cáncer desde una entrada de 400 copias de ADN amplificables, y tiene un diseño modular para adaptarse a los nuevos contenidos de genes. Dos tipos diferentes de controles definidos analíticamente proporcionan aseguramiento de la calidad y la precisión de llamadas ayudan a proteger con muestras clínicamente relevantes. Una "etiqueta" etapa de PCR flexibles incrusta adaptadores específicos de la plataforma y los códigos de índice para permitir que los códigos de barras de la muestra y la compatibilidad con los instrumentos de sobremesa común NGS. Es importante destacar que el protocolo es más sencillo y puede producir 24 bancos de secuencias listo en un solo día. Por último, el enfoque vincula los procesos de banco húmedas y secas mediante la incorporación de los resultados de control de calidad de la muestra pre-analítica directamente en la variante llamar algoritmos para mejorar la precisión de la detección de mutaciones y diferenciar falsos negativos y indeterminate llamadas. Este método utiliza NGS dirigida avances tanto en wetware y software para lograr una alta profundidad, la secuenciación y el análisis multiplexado sensible de las muestras de cáncer heterogéneos para aplicaciones de diagnóstico.
la medicina de precisión se basa en la individualización de las opciones diagnósticas y terapéuticas para los pacientes. La promesa de tratamientos a medida es una consecuencia directa de una mejor comprensión de las vías de la enfermedad que pueden informar a la vinculación de diagnóstico molecular y terapias dirigidas. Por ejemplo, el uso de terapias molecularmente dirigidas aumentó del 11% al 46% desde 2003 hasta 2013 1, y fármacos contra el cáncer tales como vemurafenib y crizotinib se aprobado por la FDA con las pruebas diagnósticas complementarias. Con su capacidad de recuperar con precisión los objetivos de secuencias de baja abundancia en todos los grupos de muestras altamente multiplexados, secuenciación de próxima generación (NGS) ha emergido como un método de elección para la evaluación de las aberraciones genéticas asociadas con el cáncer y la identificación de dianas moleculares para la medicina de precisión.
Las biopsias de tumores sólidos más comunes para las pruebas moleculares incluyen fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) y la aspiración con aguja fina (FNA) uestraens. Estas muestras están llenos de ácidos nucleicos que desafían evaluaciones precisas NGS 2-5 de baja cantidad y / o de baja calidad. Los actuales métodos de NGS comerciales para el análisis de estas muestras se basan en un mosaico de diferentes reactivos, protocolos y herramientas informáticas que representan blancos móviles de mejoras continuas. Por ejemplo, los cambios en la química y / o software de ensayo se produjo cada 1-2 meses para los kits de NGS específicas de uso más común 6. Esta inestabilidad refleja una falta de coherencia en la construcción y la verificación de un sistema unificado para NGS tipos de muestras difíciles, sobre todo para las pruebas de cáncer, y pone una carga excesiva a los laboratorios para desarrollar protocolos cohesivos que están optimizados de la muestra a los resultados. De hecho, una reciente encuesta de usuarios NGS puso de relieve las dificultades de estas "tecnologías que cambian rápidamente", junto con los requisitos establecidos para el contenido, punto de vista médico-procesable, experiencia bioinformática arraigada, una solidified y procedimiento integrado que puede ser implementado rápidamente, y simplificados flujos de trabajo y protocolos simplificados que faciliten en el puesto de trabajo 7. En este artículo, se describe un sistema integral de NGS dirigida que se ocupa de estas lagunas.
La metodología que se presenta integra todos los pasos del procedimiento de pre-analítica a la post-analítica en bancos tanto húmedas como secas para mejorar la precisión, sensibilidad y fiabilidad de la cuantificación de destino y la detección de NGS de loci de genes del cáncer clínicamente relevante. Este enfoque comienza con la cuantificación de ADN "funcional" 4 para evaluar la calidad del ADN, la guía de entrada a la etapa de enriquecimiento PCR, y proteger contra llamadas de falsos positivos que pueden derivarse de la interrogación de copias muy bajos plantilla. Un múltiplex de un solo tubo de PCR a continuación, enriquece el 46 loci en 21 genes del cáncer utilizando sólo 400 copias de ADN amplificables, seguido por la incorporación de secuencias específicas de la plataforma para NGS using escritorio comunes instrumentos de secuenciación. Las bibliotecas se purificaron usando un simple procedimiento de perlas magnéticas y se cuantificaron con una novela, ensayo qPCR libre de calibración. Una suite bioinformática independientes, informado por la muestra de ADN resultados de CC para mejorar el desempeño de la llamada, proporciona análisis de la secuencia siguiente NGS. Se presentan los datos que utilizan este enfoque de sistemas para NGS dirigida a revelar base de mutaciones de sustitución, inserción / deleciones (indeles), y número de copia variantes (CNV) en biopsias de baja calidad y tumorales de baja cantidad como FFPE y FNA muestras, y correr controles.
Tecnologías NGS han redefinido las expectativas para interrogar a los perfiles moleculares de las biopsias de tumores en el ámbito clínico 9. Una serie de paneles orientados NGS se han desarrollado como tecnologías de investigación, pruebas de laboratorio desarrollado, y los productos disponibles en el mercado y paneles personalizados para la evaluación de múltiples tipos de muestras clínicas 3,5,10-15. Los informes de múltiples estudios han demostrado el valor de NGS como herramienta clínica sensible y específico para la detección de alteraciones genómicas 3,10-12,14. Sin embargo, los estudios también han demostrado el riesgo de artefactos que pueden causar resultados falsos positivos de las biopsias de cáncer desafiantes como FFPE especímenes 2-5,12,14. Además, las publicaciones recientes han puesto de relieve altas tasas de fracaso para NGS utilizando especímenes de oncología y 16 falsos positivos llamadas con paneles NGS dirigidos comerciales que se ven agravadas por el uso de ADN de bajos insumos 12. Como resultado, algunos laboratorios han modificado o añadido pesos y contrapesos adicionales para las tecnologías comercialmente disponibles NGS dirigidos a mejorar el rendimiento, a menudo para asegurar la exactitud o confirmar los hallazgos del análisis bioinformático 5,10,11 tampoco.
El panel de 21 genes (Figura 2) fue desarrollado como el contenido destinado para un sistema integral de NGS para interrogar, mutaciones de acciones concretas basadas en la evidencia en los tipos de muestras complejas, como FFPE y biopsias de tumores FNA. El flujo de trabajo tiene una serie de ventajas: 1) la coherencia proporcionando una cobertura uniforme de amplificación (Figuras 3 y 4, Tabla 3); 2) la facilidad de uso, proporcionando pre-formulado, conjuntos de reactivos optimizados, y la simplificación de los requisitos de la bioinformática; 3) la eficiencia mediante la racionalización del flujo de trabajo y reducir el número de pasos de pipeteado en comparación con otros métodos de NGS comerciales; y 4) la precisión mediante la incorporación de un ensayo de ADN QC para la evaluación de la amplifiel número de copias de ADN capaz de asegurar la diversidad plantilla aceptable y evitar fluctuaciones estocásticas en la detección de la variante 4. La integración de los datos de control de calidad preanalítica con el análisis bioinformática permite entradas de baja de FFPE de ADN. Esto se logró mediante la formación de un algoritmo de árbol de decisiones utilizando diferentes copias funcionales de entrada de ADN a través de 400 muestras FFPE con medidas independientes de la verdad, y la incorporación de este algoritmo en el software bioinformático. Como resultado, la entrada recomendada de 400 copias amplificables, típicamente equivalentes a ~ 5-20 ng de ADN FFPE, se compara favorablemente con otros métodos 10-12, incluido el enriquecimiento basado en la hibridación que se recomienda ~ 250 ng de ADN FFPE 17,18 . Aunque la técnica se describe para su uso en una plataforma MiSeq, se puede modificar mediante el uso de cebadores de PCR de la etiqueta con los adaptadores específicos de instrumentos para permitir el análisis de secuencia en otras plataformas NGS.
Varios pasos son críticos para asegurar el éxitodel procedimiento. El ensayo de control de calidad pre-analítica determina el número de copias del ADN amplificable y los informes de la inhibición funcional. Sin embargo, si se utilizan menos de 400 copias de ADN amplificables en la etapa de enriquecimiento PCR, existe un mayor riesgo de una llamada de falsos negativos de muestras con mutaciones de baja abundancia (Figura 6). Además, se debe tener cuidado durante la purificación biblioteca para evitar el exceso de secado de las perlas magnéticas durante el lavado o elución pasos. Además, el éxito de cuantificación biblioteca depende de la dilución precisa de ADN de biblioteca de alta. Para el mejor resultado, la diferencia resulta de la qPCR para la biblioteca de la muestra (Cq FAM) en comparación con el estándar LQ (Cq VIC) debe ser ≤3.3 Cq. Si la diferencia es mayor que 3,3 Cq, re-dilución y ensayo de la muestra se recomienda. Aunque una correlación excelente se ha observado entre este método qPCR competitivo y kits comerciales que ofrecen cuantificación absoluta utilizando una curva estándar, Un desplazamiento de la entrada de la biblioteca en la etapa de amplificación clonal en relación con otros métodos puede ser necesaria para lograr densidad de siembra óptima.
Algunos especímenes de cáncer son particularmente difíciles de secuenciar debido a que persisten después de inhibidores de aislamiento de ADN. Para identificar estas muestras antes de la preparación de la biblioteca, el ensayo qPCR QC también detecta la inhibición de amplificación mediante la inclusión de una plantilla exógeno que sirve tanto como un control interno y un centinela para la inhibición funcional. Un ejemplo se presenta en la Figura 3 en la que una muestra de ADN melanoma no pudo pasar la inhibición del control de calidad métrica antes de la secuenciación y luego no pudo generar una biblioteca que podrían ser secuenciado. El fracaso fue probablemente una consecuencia de la contaminación por melanina, un inhibidor conocido de PCR, transferidos de la etapa de aislamiento de ADN FFPE. Las muestras que se identifican mediante el ensayo de control de calidad para estar en riesgo de fracaso de amplificación puede ser salvado a través de un extra de limpieza de paso to eliminar inhibidores potenciales.
El panel de 21 genes objetivo se centra en puntos calientes de genes basados en la evidencia y proporciona un sistema completo con reactivos y controles optimizados para el ADN de control de calidad, NGS y la bioinformática software que se informó por resultados de la cuantificación de ADN pre-analíticos "funcionales". El método detecta con precisión mutaciones base de sustitución y indeles a partir del ADN bajo de entrada, y proporciona un ejemplo de un sistema de NGS con la opción de ampliar contenido del panel, para detectar variantes adicionales, tales como CNV y ser adaptado para la secuenciación de ARN objetivo.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Dr. Annette Schlageter para la revisión del manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por CP120017 subvención de la Prevención del Cáncer y el Instituto de Investigación de Texas (PI: GJL).
2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
ROX | Asuragen | 145346 | |
Diluent | Asuragen | 145339 | |
DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
Index Codes (ILMN) – Set A, AIL001 – AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
AIL001 – AIL048 (48) | |||
Index Codes (ILMN) – Set B, AIL049 – AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
AIL049 – AIL096(48) | |||
2X Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
Illumina MiSeq | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
Quantidex Reporter Software | Asuragen |