用优化的n-甲基 d-葡乙胺保护恢复法制备急性脑切片

涉及转基因小鼠的程序已得到艾伦脑科学研究所机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。实验中使用了雄性和雌性 C57BL/6 小鼠 (重量范围10-30 克)。一些代表性的结果描述了从活体人脑切片收集的数据。皮层组织标本在 neurosurgeries 中获得肿瘤切除。有必要清除上覆的皮层组织, 以获得进入患病的组织。根据瑞典医学中心机构审查委员会批准的一项议定书, 在所有病例中均获得知情的患者同意, 以便为研究目的使用神经外科组织。 1. 介质和试剂的制备 (表 1) 注: 溶液应在纯净水中, 不含微量金属和其他杂质。建议在实验当天进行新的解决方案, 但如果需要, 未使用的解决方案可能存储在4摄氏度, 可达1周。以上每种配方的1升足以用于切切片程序。所有 aCSF 解决方案必须在使用卡波金 (95% O2/5% CO2) 之前饱和, 以确保稳定的 pH 缓冲和足够的氧合。所有溶液的 pH 值应调整为 7.3-7.4, 渗透压测量并调整为 300-310 mOsmol/千克。 准备 NMDG-HEPES aCSF (毫米):92 NMDG, 2.5 氯化钾, 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 葡萄糖, 2 硫脲, 5 na 抗坏血酸, 3 na 丙酮酸, 0.5 CaCl2· 2H2O, 10 MgSO4· 7H2o 滴定 pH 为7。3–7.4 17 毫升 +/-0.5 毫升5米盐酸。注: 本滴定步骤最好在添加价阳离子之前进行, 以避免沉淀;然而, 当 pH 值调整到生理范围时, 降水可以逆转。 准备 HEPES 持有 aCSF (毫米):92 氯化钠, 2.5 氯化钾, 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 葡萄糖, 2 硫脲, 5 na 抗坏血酸, 3 na 丙酮酸, 2 CaCl2· 2H2O, 2 MgSO4· 7H2o 滴定pH 值为 7.3–7.4, 几滴浓缩10氮氢氧化钠。 准备录音 aCSF (毫米): 124 氯化钠, 2.5 氯化钾, 1.25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12.5 葡萄糖, 5 HEPES, 2 CaCl · 2H 2 O, 2 MgSO 2 · 7H 4 o 滴定 pH 值 2-7.3 与几滴浓缩10氮氢氧化钠。 准备 Na+钉入溶液 (2 米): 580 毫克氯化钠溶解在5毫升新鲜制备的 NMDG-HEPES aCSF。这是足够的解决方案, 为一个脑切片准备。 准备2% 琼脂糖用于组织嵌入。在100毫升 1x PBS 和微波中溶解2克琼脂糖 1B (参见材料表), 直到沸腾。旋流混合, 然后倒入不育的10厘米培养皿的混合物, 并允许固化。将琼脂糖盘存放在4摄氏度的密封塑料袋中, 直到使用。 准备注射麻醉工作库存解决方案。混合2.5 克 22, 2-Tribromoethanol 与5毫升 2-甲基-2 丁醇, 然后逐渐溶解在200毫升 PBS, pH 7.0–7.3。使用前用0.22 µm 过滤器过滤库存溶液, 并在4摄氏度的保护下免受光照。注: 咨询各动物使用委员会关于确定麻醉工作库存解决方案的过期和处置程序的准则和规则。 2. 切片站的设置 用组织切片机和手术器械设置切片站 (请参阅材料表)。要校准切片机, 请用快粘胶将锆陶瓷喷油器刀片连接到刀片臂上, 然后插入试样架, 将刀片的前缘与试样架边缘保持一小间隙, 以确保刀片不刮金属。注: 如果刀片式服务器边缘没有物理损坏, 则可以在不替换的情况下重复使用多个星期甚至几个月。各种组织切片器模型在商业上是可用的, 其中许多可以提供最佳的性能时, 优化校准。理想的仪器应该有最小的 z 轴偏转, 无论是直接测量和调谐或经验的观察。 设置一个250毫升烧杯装满200毫升的 NMDG-HEPES aCSF 和预冷冰与恒定的 carbogenation (应用通过气体扩散石浸泡在媒体) > 10 分钟。注: 本解决方案将用于 transcardial 灌注和切片机储层充填。 建立初始的脑切片恢复室, 填充150毫升的 NMDG-HEPES aCSF (保持恒定 carbogenation), 并将房间放在一个热水浴保持在第32-34 °c。注: 推荐使用爱德华兹和 Konnerth (1992)52的设计后, 此步骤的切片室。这些房间可以提供现成的实验室项目 (250 毫升烧杯, 尼龙网格网, 50 毫升圆锥管, 35 毫米塑料圆碟)。必须小心, 以确保切片网保持无气泡, 特别是那些不断生产的卡波金气泡石, 因为这些可能会导致切片浮起来, 并成为损坏。该网应该被淹没大约1厘米的液体表面。 建立脑切片保存室;建议在较大的水库中使用多个独立井的设计 (请参阅材料表)。用450毫升的 HEPES aCSF 填充储层, 在恒定 carbogenation 下加热室温, 直至使用。注: 在电生理记录前, 脑切片将从最初的恢复室转移到本室进行长期贮存。必须注意确保切片网在任何时候都保持无气泡。 制备用于组织嵌入的熔融琼脂糖。使用一个50毫升锥形小瓶的开放端, 像一个饼干切割机, 从以前准备好的盘子里切出2% 块琼脂糖。将锥形小瓶松盖, 然后用微波炉 10–30, 直到琼脂糖融化。不要过热。 将熔融琼脂糖倒入1.5 毫升管中。在熔融状态下保持琼脂糖, 使用 thermomixer 设置为42摄氏度, 剧烈晃动。小心地确保熔融琼脂糖不会过早凝固。 在这个时候放置在冰上的切片器的配件冷块, 以预凉。 3. Transcardial 灌注 注: transcardial 灌注程序是一个重要步骤, 当与成年动物, 是重要的是实现快速冷却的大脑和减缓新陈代谢通过脑输液低 Na+, 低钙2 +/高毫克2 + aCSF解决.transcardial 灌注也有助于清除脑血管中的红细胞, 从而减少可能干扰荧光标记细胞种群在转基因线上的可视化和靶向的自发荧光。不宜省略 transcardial 灌注。 腹腔注射麻醉工作液的深麻醉小鼠 (250 毫克/千克: 0.2 毫升1.25% 麻醉工作库存溶液每10克体重, 请参阅材料表)。2–3分钟后, 通过评估脚趾捏反射, 验证足够的麻醉深度。如果需要, 注入额外的麻醉工作库存量, 并重新评估脚趾捏反射后再2-3 分钟。 负载30毫升注射器与25毫升的 carbogenated NMDG-HEPES aCSF 从预冷250毫升烧杯 (2–4°c 是最佳的, 而不是泥泞或冷冻溶液)。附上 25 5/8 口径的针。 用鼠标背上, 钉下前爪和后爪, 以保持稳定性。一个15厘米玻璃培养皿填充硬化硅胶工作良好的基础。 使用手术刀, 做一个侧向切开打开胸腔在水平的膜片。使用细剪刀切割通过两侧的肋骨保持小心, 以避免修剪心脏和肺部。 把肋骨的中心部分钉回, 露出心脏。将30毫升注射器针插入左心室, 用细剪刀切开右心房, 让血液退出心脏。 使用人工恒压压低注射器柱塞, 并将该动物与冷冻 NMDG HEPES aCSF 灌注, 速度为10毫升/分钟。注: 如果灌注成功, 肝脏将会从深红色变为浅黄色, 在某些情况下, 可以观察到在手术结束时从鼻孔中退出的透明液体。 4. 脑解剖和切片 斩首的动物。用手术刀打开头上的皮肤, 露出头骨盖。 使用精细的超切剪刀剪掉头骨盖上的皮肤, 并在头骨的尾部/腹底两侧侧向一侧的小切口。做额外的浅切口从头骨的尾部/背侧开始移动在延髓方向上的背中线注意不要损害底层的大脑。在嗅觉灯泡的水平上做一个与中线垂直的最终 ‘ T ‘ 切口。注意: 必须小心, 以确保没有损害的大脑区域的利益。特别是, 在任何时候都不应该有任何压缩力应用于大脑本身。 使用圆头钳抓住头骨开始在延髓内侧的方面, 并剥离回向尾部侧向方向。重复双方打开和删除头骨的背半部分, 以揭露大脑。轻轻地挖出完整的大脑进入预冷 NMDG-HEPES aCSF 的烧杯中。让大脑均匀冷却1分钟。 使用大铲把大脑从烧杯中抬出来, 放到用滤纸覆盖的培养皿上。根据切片的首选角和所需的大脑区域来修剪和阻挡大脑。快速工作, 避免在搬运过程中长期缺氧。注: 许多切片角度是可能的。精确的阻断方法和切片角度将取决于精确的脑区、细胞类型和要研究的电路。 用粘胶将脑块贴在标本架上。收回标本持有人的内块足以完全撤回脑块内。将熔融琼脂糖直接倒入支架内, 直至脑块完全覆盖在琼脂糖中。夹紧前冷却附件冷却块周围的标本持有人为 ~ 十年代直到琼脂糖凝固。 将试样架插入切片机上的插座, 并验证正确的对齐方式。用剩余的预冷、含氧 NMDG HEPES aCSF 从250毫升烧杯中填满储层, 并在切片期间将气泡石移入油藏, 以确保充分的氧合。 调整千分尺开始推进琼脂糖嵌入脑标本。启动切片器并经验主义地将前进速度和振荡频率调整到所需的水平。注意: 这两个设置应该在低范围内。为了获得最佳效果, 一刀臂的单一通行证应大约二十年代, 振荡应产生一个非常平滑和柔和的嗡嗡声, 没有明显的嗡嗡作响。 继续推进和切片的组织在300µm 增量 (或其他首选厚度), 直到大脑区域的利益完全切片;切片过程的总时间应小于15分钟。 5. 优化 NMDG 保护恢复程序 初始 NMDG 恢复步骤 (关键步骤): 在切片过程完成后, 使用截止塑料巴斯德管 t 收集所有切片, 并将其转移到预热 (34 °c) 的初始恢复室, 填充150毫升NMDG-HEPES aCSF。当所有切片移动到恢复腔中时, 立即转移所有切片并启动计时器。 请参阅表 2以根据鼠标的年龄确定最佳 Na+峰值时间。注: 本程序是一种实用的方法, 可实现将 Na+重新引入脑切片腔的控制速率, 并针对特定的脑切片室几何和储层体积和类型进行了优化 (请参阅材料表)。 通过在指定的时间添加 na+钉入解决方案的指示卷, 执行逐步 Na+峰值过程。将 Na+钉入解决方案直接添加到初始回收室的涌泉烟囱中, 以方便快速混合。 将所有切片转移到 HEPES aCSF 在室温下保持的长期保持室。在启动膜片钳记录实验之前, 允许切片在 HEPES 保持室中恢复1小时。 6. 膜片钳记录 注意: 以下基本过程只是提供了一些实际的注意事项, 并不打算代表补丁夹录音的详细协议, 因为这些程序可以在其他53、54中找到。这个应用需要一个膜片钳电生理钻机。这通常是由一个直立显微镜, 配备红外差分干涉对比 (IR-DIC) 光学和荧光照明系统, 膜片钳放大器和数据数字化仪, 机动机器人和显微镜平台, 隔振台, 法拉第笼, 及溶液加热和灌注系统。样品室和平台应设计为浸没切片记录。对于多神经元膜片钳录音, 需要配备多个放大器、头级和高质量并联的钻机。此外, 为了获得最佳效果, 我们极力推荐配备 900 nm 红外波段通滤波器和匹配光学元件的钻机, 以确保在脑切片的深部 > 50 µm 细胞的充分可视化。Kӧhler 照明的正确对准对清晰的可视化也很重要。 制备胞内吸管溶液 (毫米): 130 克葡萄糖酸盐, 4 氯化钾, 10 HEPES, 0.3 EGTA, 10 磷酸肌酸-Na2, 4 MgATP, 0.3Na2-GTP, 13.4 biocytin。调整 pH 值为7.35 与1米 KOH 和渗透压 285–290 mOsmol/千克使用蔗糖的需要。 从厚壁硅酸盐玻璃毛细管中制备膜片钳电极;理想的膜片钳电极有一个相对短和粗锥形与〜3–6毫欧填充尖端电阻在浴缸。 确保银电极线正确 chlorided, 以确保稳定的记录。做这 (典型) 通过淹没最后3-4 毫米银色导线在液体漂白剂大约30分钟或直到导线变黑。 用蠕动泵建立溶液灌注, 3–4毫升/分钟. 通过记录室循环 carbogenated 记录 aCSF, 注意匹配流入和流出以避免溢出。 将单个脑切片转移到浸没记录室中, 并使用带有尼龙十字弦的 U 形切片锚将其固定到位。在切换到更高功率目标 (例如、高数值孔径40X 或60X 水浸泡目标) 之前, 使用4X 空气目标识别目标大脑区域。 直观地识别一个健康的目标细胞。由红外-DIC 显微镜可视化的神经细胞膜在躯体上的出现, 用于判断候选细胞是否适合于膜片钳记录。注意: 健康的神经元通常表现为以下特点: 既不萎缩也不肿胀胞体, 膜边缘的软对比, 以及平滑的膜外观。此外, 大多数健康细胞位于30µm 深的切片, 因为肤浅的神经元可能会被破坏的树突状过程。出现皱纹的神经元, 清晰可见的细胞核或 ‘ 煎蛋 ‘ 的外观, 或非常黑暗或高对比膜边缘应避免。 背部填充5µL 细胞内溶液的贴片吸管, 并将其加载到电极支架上。将吸管移入脑切片上方的记录浴缸中, 并应用轻正压以清除尖端中的任何障碍物。使用膜测试功能将吸管偏移量降至零, 并对尖端电阻进行监测。 将吸管尖端与靶神经元的细胞体接触;由于光线正压, 在膜表面形成一个小酒窝。 一旦膜酒窝被观察, 迅速消除正压和应用温和吸力, 以方便密封的形成。一旦吸管阻力增加到 > 100 毫欧, 打开一个保持命令的水平, 匹配预期的静止膜电位的目标细胞类型 (-70 mV 是一个很好的出发点)。 一旦尖端阻力达到≥1 gigaohm, 试图打破细胞在贴片吸管下面使用短暂的尖锐吸力的膜断裂;”电击” 功能可用于在需要时方便闯入。注: 在皮层神经元的电压钳实验中, 提出了-70 mV 的保持电位。在实验期间, 健康神经元的漏电流不会超过-100 pA, 但这部分依赖于细胞类型。如果静止膜电位比-50 mV 更偏振光, 或者如果接入电阻改变了20% 以上, 神经元将被排除在分析之外。 一旦获得稳定的全细胞膜片钳记录, 目标额外的神经元, 以记录重复步骤6.6–6.10。注意避免机械干扰会导致丢失第一个录音。 从第一个神经元中选择100µm 内的其他神经元, 以确保找到 synaptically 耦合神经元的合理概率。注意: 在建立第一个膜片钳记录之前, 在某些情况下, 在前置多个候选神经元并预先加载和预置所有吸管到各个目标细胞上可能会有帮助。