Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Dendritische cellen (DC) werden ontdekt bijna veertig jaar geleden als "grote stervormige (Griekse dendron) cel" in lymfoïde organen ^1. Vele studies hebben aangetoond dat DCs de enige antigeen presenterende cellen die effectief naïeve T-cellen ² kunnen stimuleren. Een belangrijke functie van deze cellen is de opname en presentatie van antigenen en de efficiënte verwerking en het laden van deze op antigeen presenterende moleculen. In muis milt, kan DC worden gescheiden in plasmacytoide en conventionele subsets. De plasmacytoide DCs worden gekenmerkt door lage expressie van CD 11 c en een hoog niveau van de B220 en Gr-1. Ze zijn ook positief voor de oppervlakte marker mPDCA1 en scheiden type I interferon in reactie op toll-like receptor 9 (TLR9) liganden. De conventionele DC's zijn hoog voor CD11c en MHC klasse II expressie. Zij kunnen worden verdeeld in drie subgroepen op basis van de oppervlakte-expressie van fenotypische merkers zoals CD4, CD8a, DEC205, CD11b en dendritische celtherapie remmende receptor 2 (DCIR2, erkend door de 33D1-antilichaam) eiwitten ^3,4. De CD8a ^Pos DCs worden ook wel CDC1, zijn positief voor DEC205, maar negatief voor myeloïde merkers zoals CD11b en 33D1. De CD8a ^Neg DC's, ook wel cdc2, zijn positief voor 33D1, CD11b en CD4, maar gebrek aan DEC205. De dubbele negatieve subgroep (dwz negatief voor zowel CD4 en CD8a) is relatief zeldzaam, en is negatief voor DEC205 en 33D1. Het de minst gekarakteriseerde subgroep en kunnen minder gedifferentieerde vorm van CD8a ^Neg gelijkstroom.

Fenotypische verschillen in de verschillende DC subsets worden uitgebreid tot de in vivo functies. De CD8a ^Neg DCs sterk fagocytische en men denkt dat exogeen antigen zetten vooral via MHC klasse II aan CD4 T-cellen ^3. In tegenstelling, de CD8a ^Pos DCs zijn gespecialiseerd voor het aanbrengen van oplosbaar eiwit antigeen op MHC klasse Ieen mechanisme genaamd cross-presentatie. Het resultaat van cross-presentatie is afhankelijk van de activeringsstatus van deze DCs ^5, en kan zowel leiden tot uitbreiding van cytotoxische T-cellen (CTL's) of de ontwikkeling van regulerende T-cellen ^{6 2,7.} Targeting van antigeen aan CD8a ^Pos DCs met behulp van anti-DEC205-antilichaam-gemedieerde levering resultaten grotendeels in de verwijdering van T-cellen ^8, terwijl de presentatie van de antigenen afkomstig van geïnfecteerde apoptotische cellen een sterke CTL-respons ⁹ induceert.

Naast herkenning van peptide-antigenen is het immuunsysteem van zoogdieren ontwikkeld om lipide en glycolipide antigenen herkennen. Deze antigenen worden door CD1 moleculen, die MHC klasse I-achtige celoppervlakte-eiwitten die bestaan ​​in verschillende verwante vormen in diverse zoogdieren. In muizen, één soort sterk geconserveerde CD1 molecuul genaamd CD1d is verantwoordelijk voor de presentatie glycolipide antigenen ^10. De burgemeester populatie van T-cellen die CD1d / glycolipide complexen herkennen heet invariante NKT cellen (iNKT cellen). Deze cellen brengen een semi-invariante T-celreceptor (TCR), bestaande uit een invariant TCRα keten die is gekoppeld aan TcR ketens met een beperkte diversiteit ^11. In tegenstelling tot conventionele T-cellen die moeten groeien en te differentiëren tot geactiveerde effector-T-cellen, iNKT cellen bestaan ​​als een effector bevolking en begint snel te reageren na glycolipide toediening ^12. Identificatie van fysiologisch relevante lipide antigeenpresenterende cellen is een actief gebied van onderzoek en een aantal verschillende celtypes zoals B-cellen, macrofagen en DC's zijn voorgesteld voor deze functie. Er werd aangetoond dat de CD8a ^Pos subset van DC is de primaire cel medieert opname en presentatie van lipide antigenen muizen- iNKT cellen ¹³ en glycolipide gemedieerde cross-priming van CD8 T-cellen ^14.

ove_content "> Om de efficiëntie van antigeenpresentatie vergelijken met andere antigeenpresenterende cellen, een eenvoudige aanpak is om verschillende gezuiverde APCs gepulst met equivalente hoeveelheden van antigeen in naïeve gastheer. celoverdracht experimenten van dit type worden vaak uitgevoerd voor immunologische studies te dragen. echter, het uitvoeren van overdracht studies ex vivo antigeen behandelde DCs uitdaging, aangezien deze cellen bestaan ​​zeldzame populaties in lymfoïde organen, waar ze minder dan 2% van de totale cellen ¹⁵ vormen. daarom moet de ontwikkeling van deze cellen in donordieren verbeteren de efficiëntie van isolatie protocollen te verhogen.

Het is bekend dat de gemeenschappelijke lymfoïde en myeloïde voorlopercellen gemeenschappelijke, die nodig zijn voor het genereren van pDC, CD8 en CD8 ^{Pos Neg} DC subsets, express fms-gerelateerde tyrosine kinase receptor 3 (Flt-3). Bij het ​​in vivo Flt-3-ligand (Flt-3L) administratie, emigration van Flt-3 tot expressie stamcellen uit beenmerg wordt verhoogd, leidt tot een toegenomen zaaien van perifere lymfoïde organen en de uitbreiding van de rijpe DC ¹⁶ nageslacht. Expressie van Flt-3 is verloren tijdens betrokkenheid bij de B, T of NK-celdifferentiatie paden. Daarom worden slechts minimale veranderingen waargenomen in deze cellen op Flt-3L administratie. Vertaald expansie DC populaties waargenomen in muizen die tumoren opgewekt door implantatie van B16-melanoom cellijn afscheidende muis Flt-3L, welke een eenvoudige en economische methode voor het verschaffen van langdurige systemische niveaus van Flt-3L ^17,18 bepaalt. Met deze benadering hebben we een protocol gebaseerd op de implantatie van B16-melanoom cellen die Flt-3L de uitbreiding van alle normale DC subsets in muismilt stimuleren, waardoor aanzienlijke verhoging van de opbrengst van deze cellen kunnen worden geïsoleerd voor verdere experimenten ontwikkeld . We consequent vinden dat binnen 10 – 14 dagen na subcutane implantage van de Flt-3 afscheidende tumor, muizen ontwikkelen splenomegalie met duidelijke verrijking van DC tot 40 vormen – 60% van de totale miltcellen. Uit deze milt kunnen verschillende DC subsets worden geïsoleerd met hoge zuiverheid met behulp van standaard in de handel verkrijgbare cel zuivering kits die subgroep-specifieke fenotypische markers in dienst.