정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성
Summary
Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.
Abstract
Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.
Introduction
Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.
Protocol
Representative Results
Discussion
하는 마이크로 확산 분석 및 염료 방출 분석은 이전에 검출 및 미확인 된 단백질을 특성화 항생제 효과를 제공한다. 이 신속하고 민감한 방법은 더 많은 연구 자원을 투자하기 전에 관심이 효소의 식별을위한 생물 소스 라이브러리의 높은 처리량 검사를 할 수 있습니다. 명확한 표적 효소가 발견되기 때문에, 검출 분석의 변형이 급격히 효소를 검출하거나 효소의 생화학 적 특성을 결정하기 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 다단계 단백질 정제 기법 중에 확산하는 마이크로 분석 급속 관심 효소를 함유하는 분획을 검출 할 수있다. 또한, 효소 반응 OPTIMA 염료 방출 분석에서 반응 버퍼 및 배양 온도 변화에 의해 결정될 수있다.
하는 마이크로 확산 분석에서의 검출에 필요한 효소 질량의 범위는 효소 characteri의 함수stics. 분석의 검출 한계는 일반적으로 염료를 방출 분석법보다 더 많은 양의 효소의 사용을 필요로한다. 이 연구에서, 상기 염료 방출 분석 (도 4)로하는 마이크로 확산 분석 (도 1)의 검출 한계 비교를하는 마이크로 확산 분석법 염료 방출 분석보다 덜 민감한 기술임을 도시. 효소 농도가 중요하지 않은 경우, 마이크로 슬라이드 분석은 낮은 노동 및 설비 요구에 대하여 타깃 기판 단백질 항균제의 제조를위한 라이브러리의 신속한 초기 선별을 허용한다. 많은 노력과 장비를 필요로하지만, 염료 방출 분석은 주어진 기판에 대해 동일하거나 상이한 효소 염료 방출 분석법 간의 비교를 정량적 결과를 얻었다 더 민감하고 재현성이다. 두 가지 방법을 쉽게 고도의 전문 장비 필요없이 대부분의 미생물 실험실에서 수행된다. representa에서하는 마이크로 확산 분석에서 검출 된 상기 최소한 1 μg의 (도시되지 않은 데이터) 동안적인 분석은, 제어 효소 α-키모 트립신은 염료 방출 분석을 이용하여 100 NG (도 5)의 낮은 양으로 발견되었다.
항균성 효소 질적 검출법으로 유틸리티를 제공 확산 분석의 다수의 변형 11,13보고되었다. 이러한 분석을 검토에서하는 마이크로 확산 분석은 초기 화면으로 상대적으로 높은 감도와 반응 준수의 용이성을 위해 개발되었다. 단백질은으로 우물에서 확산로 아가 오버레이 포도상 구균 균주에 의해 뉴 클레아 제의 생산을 검출하기 위해 사용 된에 Lachica 외. (11)의 작업에서 수정 상기 마이크로 슬라이드 확산 분석법 방사상 면역 확산 방법 (14)와 유사하게 작동 아가로 기판을 포함. 반경 방향 immunodiffu시스템은 아가 내의 확산 항원과 항체 간의 복합체 형성의 평형에 도달 할 때 시온 방법은 면역의 영역의 확장을 중지. 대조적으로, 마이크로 슬라이드 확산 분석의 기판은 초기에 잘 용해 주변의 계속 확장 영역에서 확산 항균 단백질에 의해 분해된다. 효소가 활성을 잃는다 또는 기판이 소진 될 때까지 영역의 증가 직경이 계속됩니다. 용해 구역의 생산 속도는 효소의 순도, 따라서 특정 활동으로 소생 또는 효소의 농도가 증가 웰에 첨가 하였다.
정량적 열 사망 단백질 B. 대해 항균제의 효소 활성을 평가하기위한 서브 틸리 스, 염료 자료 분석은 선택되었다. Remazol 화려한 푸른 R 염료 (RBB)를 사용하여 비색 분석은 기질 단백질 항균 activi의 다양하고 중요한 평가를 할 수 – 표지타이. 쉽게 595 nm에서 분광 광도계로 측정 할 수 가용성 청색 제품 릴리스 RBB 표지 기판 결과의 효소 가수 분해. 다른 항균 단백질 효소의 특성을 개발 RBB 염료 방출 분석의 여러 변형, 다른 기판과 응용 프로그램이 분석의 유연성을 보여준다. 예를 들어, 활성 bacteriolytic lysostaphin의 효과를 결정하는데, 저우, 등., RBB 염색 포도상 구균 세포 및 기판 (12)을 이용하여 포도상 구균 펩티 색소 분리 분석법을보고 하였다. 이 RBB 염료 방출 분석의 응용 예의 변형 예에서, RBB 표지 마이크로 코커스 루 테우스 (Micrococcus luteus) 기판은 세균성 감염과 악성 종양의 존재와 같은 질병을 진단하기위한 빠르고 민감한 방법으로 사용 스크린 제안 된 수 혈청 15 인간 리소자임 발현 수준과 상관 될 수있다. 또한, RBB 표지 된 박테리아 세포 기질을 가지고LSO 리소자임 (16)의 검출을위한 방법 zymogram 사용되고.
우리는 효소 생산을위한 빠른 라이브러리 스크리닝을 허용, 염료 자료 분석의 저하 검출 한계, 편리 성 및 재현성을 보여줍니다. 분석의 수정은 온도, pH, 염분의 효과뿐만 아니라 항균 단백질 (6)의 활성에 다른 단백질 분해 효소의 효과를 포함 하류 정량적 생화학 적 특성 분석을 위해 수 있습니다. 또한, 정량적 인 염료 방출 분석은 주어진 기판에 대해 여러 효소의 활성을 비교하기 위해 사용될 수있다. RBB 염료 자료 분석은 특성화 및 단백질 항균제 검출 외에 다당류에 대한 활성을 갖는 효소 유틸리티를보고했습니다. Pettersson이와 에릭손은 셀룰로스, 자일란, 만난 및 전표의 비정질, RBB 염색 폴리 사카 라이드 비드를 사용하여 endoglycanase 활동을 검출하는 분석보고십칠인치 이러한 연구 결과의 확장에서, 바실러스 투 린지 엔시스 비티-107에 의해 생성 키티 나제 효소의 검출을위한 중요한 방법은 RBB (18)로 표지 콜로 이달 키틴을 사용하여 개발되었다. 이들과 다른 연구, RBB 염색 기판 시판 소스 케라틴, 아밀로펙틴, 아밀로스, 글리코겐, 라미 나린, D- 자일란, 아조 – 보리 글루칸 전분 대 포함한 당분 활성의 검출에 사용 나왔다.
본 연구에서는 비색 결과를 생성하는 데 필요한 RBB 표지 된 기질 및 효소의 양을 감소시키는, 마이크로 포맷 염료 방출 분석의 유용성을 입증한다. 도 4 및도 5에 도시 된 바와 같이, 마이크로 염료 방출 분석은 효소 활성 검출 용 마이크로 슬라이드 확산 분석법보다 더 낮은 검출 한계를 제공한다. 해석의 신속한 사용에 관하여, 노동의 보존, 그리고 쉽게, 마이크roslide 확산 분석은 항균 활성의 존재뿐만 아니라 다운 스트림 단백질 분리 및 정제 단계에서 항균 단백질 존재의 표시에 대한 초기 높은 처리량 화면에서 유틸리티를 제공합니다. 두 분석의 조합은 신규 한 단백질 항균제의 초기 스크리닝 및 특성화 궁극적으로 서로를 보완
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.
Materials
| 48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid | Becton Dickinson | 3078 | |
| 96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) | Corning, Inc. | 3595 | |
| agarose | Fisher Scientific | BP162-100 | |
| α-chymotrypsin | MP Biomedicals | 215227205 | |
| Bacillus subtilis 168 | American Type Culture Collection | 23857 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| cork borer | Humboldt | H-9661 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| McFarland equivalence standard (2.0) | Fisher Scientific | R20412 | |
| microslides | Fisher Scientific | 22-38-103 | |
| nutrient broth | Fisher Scientific | S25959B | |
| peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 | Sigma-Aldrich | 69554-10MG-F | |
| phosphate-buffered saline (1×) | Teknova | P0200 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Life Technologies | 23227 | |
| Synergy HT microplate spectrophotometer | BioTek Instruments, Inc. | ||
| Remazol brilliant blue R dye (RBB) | Sigma-Aldrich | R8001 | |
| Salmonella enterica subsp. enterica | American Type Culture Collection | 10708 | |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film | Diversified Biotechnology | T-TOPS-50 | |
| UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution | |||
| agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose |
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution | ||
| nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water |
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| 250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water |
|||
| 200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution |
Referencias
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