Visualisierung von Twitching Motilität und Charakterisierung der Rolle des<em> Pilg</em> in<em> Xylella fastidiosa</em
Summary
In dieser Studie wurde ein Nano mikrofluidischen Strömungskammer wurde verwendet , um die Zuckungen Motilität von Xylella fastidiosa zu visualisieren und funktionell zu charakterisieren, ein Bakterium , das Pierce-Krankheit in Weinrebe verursacht.
Abstract
Xylella fastidiosa ist ein Gram-negative nicht-flagellated Bakterium , das eine Reihe von wirtschaftlich bedeutenden Pflanzenkrankheiten verursacht. Die Zuckungen Motilität bietet X. fastidiosa ein Mittel für den Ferninnerbetrieblichen Bewegung und Kolonisation, einen Beitrag zu Pathogenität in X. fastidiosa. Die Zuckungen Motilität von X. fastidiosa wird von Typ IV – Pili betrieben. Typ IV – Pili von Xylella fastidiosa werden durch Pilg geregelt, einem Chemotaxis – Regler in Pil-Chp Operon für Proteine kodiert , die mit Signaltransduktionswege beteiligt sind. Um die Rolle von Pilg im Zucken Motilität von X. aufzuklären fastidiosa, ein Pilg defizienten Mutante Xf ΔpilG und seinen komplementären Stamm XfΔpilG- C enthält nativen Pilg entwickelt. Ein mikrofluidischen Kammern mit einem Zeitraffer-Bildaufnahmesystem integriert wurde verwendet , Zucken Motilität in XfΔp zu beobachtenILG, XfΔpilG- C und seine Wildtyp – Stamm. Unter Verwendung dieses Aufzeichnungssystem ermöglicht es langfristige räumliche und zeitliche Beobachtungen der Aggregation, Migration einzelner Zellen und Populationen von Bakterien über Zucken Motilität. X. fastidiosa Wildtyp und komplementäre XfΔpilG- C – Stamm zeigte typische Zucken Motilität Eigenschaften direkt in den mikrofluidischen Strömungskammern beobachtet, während Mutante XfΔpliG die Zuckungen defizienten Phänotyp aufwiesen. Diese Studie zeigt , dass Pilg zur twitching Motilität von X. trägt fastidiosa. Die mikrofluidischen Strömungskammer für das Beobachten twitching Motilität als Mittel verwendet.
Introduction
Xylella fastidiosa ist ein Gram-negative nicht gegeißelt, pathogene Bakterium , das eine Reihe von wirtschaftlich wichtigen Pflanzenkrankheiten verursacht, einschließlich Pierce-Krankheit in Weinrebe (Vitis vinifera L.) 1,2, 3. Dieses Bakterium ist begrenzt auf den wasserführenden Xylem Schiffe. Die Infektion der Weinrebe bewirkt , dass die Blockade der Xylemgefäße und führt zu Wasserstress und Mangelernährung 3. Erfolgreiche Besiedelung hängt von der Fähigkeit des Bakteriums von der anfänglichen Stelle der Infektion mit dem Rest der Anlage 3 zu bewegen. Zucken Motilität ist ein Mittel der Flagellen-unabhängige Bakterien Bewegung durch die Erweiterung, Anhaftung und das Zurückziehen des polaren Typ IV – Pili 4 , die in X charakterisiert wurde fastidiosa 5,6,7.
Die Zuckungen Motilität wurde durch Laser – Pinzette und Rasterkraftmikroskopie (AFM) 8,9,10 beobachtet. Unter Verwendung dieser Techniken twitching Motilitäten von Typ – IV – Pili von N. erzeugt gonorrhoeae und P. aeruginosa wurden durch fl uorescently Kennzeichnung Pili charakterisiert und ihre Bewegungen mikroskopisch zu erfassen. Obwohl beide Verfahren die Haftkraft der einzelnen Bakterien detailliert sind, sind die Verfahren kompliziert und zeitraubend 9,10. Die Mikro fluidischen Kammern wurden verwendet , 5,6 Fern Migration von einzelnen Zellen sowie kleine Aggregate von Bakterienzellen zu beobachten. Diese Kammern wurden als mikrostrukturierte -Nano-Kanal in einer Platte gestaltet , integriert mit einem Zeitraffer-Bildaufnahmesystem 11,12,13,14. Micro fluidischen Kammer Geräte mehrere Vorteile für die Untersuchung der Bewegungsverhalten und Zell-Zell-Wechselwirkungen von Bakterien bieten: (i) es stellt eine integrierte Plattform mit Mehrkanal-Fähigkeiten; (Ii) kann es die Bewegungen und Aggregationen von einzelnen Zellen in den nanoskaligen Eigenschaften von Bakterien zu untersuchen; (Iii) es erlaubt die direkte microscopic Bildaufzeichnung von Bakterienzellen und Zeitraffer-Analyse, (iv) es bietet langfristige räumliche und zeitliche Beobachtungen einzelner und / oder Populationen von Bakterien in einer Mikro-Umgebung; (V) die Strömungsgeschwindigkeit des Kulturmediums in einen Kanal genau gesteuert werden kann, und (vi) nur ein sehr kleines Volumen (1 ml) des Kulturmediums wird für jedes Experiment erforderlich.
Vor kurzem hat die Mikro fluidischen Strömungssystem wurde das Verhalten von Bakterienzellen unter verschiedenen Mikroumgebungen 14,15,16 zu untersuchen , beschäftigt. Die Haftfestigkeit und die Oberflächenbefestigung von E. coli 15, X. fastidiosa 16 und Acidovorax citrulli 14 auf Glasoberflächen wurden unter Verwendung von Mikro fluidischen Kammern beurteilt. Die Aggregation und Biofilm – Bildung durch Typ IV – Pili von Acidovorax citrulli vermittelt wurden 14 analysiert. Ferner kann die Bewegung der A. citrulli beobachtet unter fl ow cie Bedingungen gezeigt , dass der Typ IV – Pili eine wichtige Rolle bei der Besiedlung spielen kann und von A. verbreiten citrulli in Xylemgefäße unter dem Splint fl ow Bedingungen. Die Zuckungen Motilitäten von Pseudomonas aeruginosa und X. fastidiosa Zellen wurden gegen einen Flüssigkeitsstrom in einer mikrofabrizierten Strömungskammer 5,6,17 erfolgreich beobachtet. Typ – IV – Pili – defizienten pilB und pilQ Mutanten von X. fastidiosa wurden 5,6,18 die Geschwindigkeit der Zucken Motilität unter den Strömungsbedingungen in Mikro fluidischen Geräten zu tiefgreifend verändern gefunden. Die Studien , die auf bakterielle Adhäsion und Motilität in Mikro fluidischen Vorrichtungen zeigten , dass die Mikro fluidischen Kammern sind besonders geeignet für die Analyse der Zuckungen Motilität und Migration von Pili-vermittelten Bakterien in vitro. Diese Ergebnisse erklären die Zuckungen-vermittelte Migration Mechanismus, der Zell-Zell-Bindung erleichtert, Aggregation und Kolonisierung innerhalbder Wirt, führen schließlich zu einer systemischen Infektion.
Pil-CHP – Operon von X. fastidiosa enthält Pilg, Pili, pilJ, pille, chpB und KWKK die Transduktion kodieren Signal 20 Pfade. Die Transchemorezeptoren binden chemische Reize in den periplasmatischen Domäne und aktivieren eine Signalkaskade in ihrem Cytoplasma-Teil, um schließlich bakterielle Zucken Motilität kontrollieren. Im Pil-CHP – Operon von X. fastidiosa, ein Phospho-Shuttle – Protein Pilg ist ein Homolog zu CheY. In E. coli und P. aeruginosa, ist CheY die Antwortregulator in Chemotaxis – Systeme , die 19, 21 mit den Geißeln Motorproteine interagieren. Obwohl die Beiträge des Pil-Chp Operon zu Virulenz in X. fastidiosa wurden kürzlich 20, die Rolle der Pilg in Chemotaxis – Operon in Reaktion auf die Umgebungssignale und geregelt / Motor Typ IV – Pili von X. sucht fastidiosa ist unclear. Um die Einsicht der Chemotaxis Regler Pilg in der Aktivität der Zucken Motilität von X. aufzuklären fastidiosa, einem Mikro fluidischen Kammer verwendet , um die Zuckungen Motilität von X. zu beurteilen fastidiosa. Die Pilg von X. fastidiosa wird durch den Vergleich der Phänotypen einer Deletionsmutante Xf ΔpliG, komplementären Stamm XfΔpliG -C und ihrem Wildtyp in vitro charakterisiert. Die Ergebnisse unterstreichen die Rolle der Pilg im Zucken Motilität von X. fastidiosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie charakterisierten wir das Bewegungsverhalten von X. fastidiosa Pilg Mutante Xf ΔpilG und seinen komplementären XfΔpilG- C – Stämme in neu mehrere parallel-Nano-Kanal Mikro fluidischen Kammern ausgelegt. Die neu entwickelten Mikro fluidischen Kammern können bis zu vier parallelen Kammern haben mit 100 & mgr; m Nanokanal in der Breite im Vergleich zu früheren Konstruktionen mit nur einem einzigen 50 & mgr; m breiten Kanal 18. Die verbes…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service unterstützt. Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in dieser Veröffentlichung sind der Bereitstellung von spezifischen Informationen ausschließlich für den genannten Zweck und Empfehlung oder Billigung nicht durch die United States Department of Agriculture implizieren. USDA ist eine Chancengleichheit Anbieter und Arbeitgeber.
Materials
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., wt al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
Referencias
- Purcell, A. H., Hopkins, D. L. Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).
- Purcell, A. H. Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat. J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).
- Hopkins, D. L. Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants. Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).
- Mattick, J. S. Type IV pili and twitching motility. Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).
- Meng, Y., et al. Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility. J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).
- Li, Y., et al. Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation. Microbiology. 153, 719-726 (2007).
- Simpson, A. J. G., et al. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature. 406, 151-157 (2000).
- Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. Single pilus motor forces exceed 100 pN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).
- Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy. J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).
- Skerker, J. M., Berg, H. C. Direct observation of extension and retraction of type IV pili. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. Shear-dependent ‘stick-and-roll’ adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli. Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers. FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).
- Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. , 751-759 (2005).
- Fuente, D. L., et al. Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).
- DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa. Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).
- Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).
- Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response. J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).
- Cursino, L., et al. Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa. Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).
- Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays. Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).
- Costa, H. S., et al. Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards. Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).
- Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU. Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).
- Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).
- Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. Isolation Media for the Pierce’s Disease Bacterium. Phytopathology. 70, 425-429 (1980).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).
- Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives. Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).
- Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).
