Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

O objectivo da experiência é a imagem e caracterizar o fluxo molecular de filamentous- (F-) actina em células T vivo, para além do limite de difracção, a fim de estabelecer a direcção do fluxo e durante a magnitude sinapse imunológica (IS) formação. Esta técnica irá ser realizada utilizando um microscópio de iluminação estruturada (SIM) no modo de reflexão interna total de fluorescência (TIRF), imagiologia de células T de Jurkat que formam uma sinapse artificial sobre a activação das lamelas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28. Os formulários está entre uma célula T e seu alvo; uma célula que apresenta antigénios (APC) em cima do receptor de células T (TCR) ^1,2 activação. Como esta é a primeira etapa para determinar se o sistema imunitário adaptativo gera uma resposta imunitária a uma infecção, as consequências da capacidade de resposta a estímulos incorrecta pode provocar um certo número de doenças. A importância da interacção de células T-APC está bem documentada, no entanto, o papel (s) do maduro é depois Si TCR inicialinternalização nal ainda estão para ser totalmente compreendido.

Como o citoesqueleto é pensado para auxiliar dois processos ligados à activação de TCR (o movimento de moléculas na membrana plasmática e do controlo de moléculas de sinalização dependentes do citoesqueleto de actina ^3,4), compreender como o citoesqueleto reorganiza espacial e temporalmente irá elucidar os passos de reorganização molecular durante a formação de sinapses. O fluxo retrógrado de F-actina é pensado para encurralar aglomerados de TCR em direcção ao centro da sinapse imunológica, esta translocação se acredita ser fundamental para a cessação do sinal e de reciclagem; auxiliando o bom equilíbrio de activação de células T ^5.

Enquanto a microscopia de fluorescência padrão é uma ferramenta flexível que continua a fornecer uma visão sobre muitos eventos biológicos, incluindo interações célula-célula, ela é limitada pela capacidade do sistema para resolver com precisão vários fluoróforos que residem mais perto do que o diffrlimite de acção (≈200 nm) de cada outro. Como muitos eventos moleculares dentro das células envolvem densas populações de moléculas e apresentam rearranjo dinâmico quer na quietude ou mediante estimulação específica, microscopia de luz convencional não fornece a imagem completa.

A utilização de super-resolução de imagem permitiu a investigadores para contornar o limite de difracção utilizando uma variedade de técnicas. Microscopia molécula única localização (SMLM), tais como PALM e STORM ^6,7 tem a capacidade de resolver o local de moléculas até uma precisão de cerca de 20 nm, no entanto, estas técnicas dependem de longos tempos de aquisição, a criação de uma imagem ao longo de muitos quadros . Geralmente isso requer amostras a serem fixos ou para estruturas mostrou baixa mobilidade fluorophores tão simples não são mal interpretados como vários pontos. Enquanto esgotamento emissão estimulada (STED) imagiologia permite super-resolução através da excitação confocal muito seletivo ^{8, a} digitalização necessáriaabordagem pode ser lento sobre os campos de células inteiras de vista. STED também demonstra fototoxicidade significativo para resoluções mais elevadas devido ao aumento do poder do feixe de esgotamento.

Microscopia de iluminação estruturada (SIM ⁹⁾ proporciona uma alternativa a estes métodos, capazes de duplicar a resolução de um microscópio de fluorescência padrão e é mais compatível com a imagem de células vivas do que as técnicas correntes SMLM. Ele usa poderes de laser inferiores, em um sistema de campo amplo para campos de células inteiras de vista; proporcionando maior velocidade de aquisição, e é compatível com rotulagem fluoróforo padrão. A natureza de campo amplo de SIM também permite a utilização de fluorescência total interno de reflexão (TIRF) para excitação altamente seletivo, com profundidades de penetração na dimensão axial de <100 nm.

Espectroscopia de correlação de imagem (ICS) é um método de correlacionar as flutuações na intensidade de fluorescência. Uma evolução do ICS; Im espaço-temporalespectroscopia de correlação de idade (STICS ¹⁰⁾ correlaciona sinais fluorescentes intracelulares no tempo e no espaço. Ao correlacionar intensidades de pixel com áreas pixels em quadros mais atrasadas através de uma função de correlação, a informação é adquirida com as velocidades de fluxo e direcionalidade. Para garantir objectos estáticos não interfiram com a análise STICS, um filtro objecto imóvel é implementado, o qual funciona através da subtracção de uma média móvel da intensidade dos pixels.

A técnica aqui apresentada acredita-se ser a primeira demonstração de espectroscopia de correlação de imagem a ser aplicada aos dados de microscopia de super-resolução para quantificar o fluxo molecular em células vivas ^11. Este método melhora na imagem limitado por difração de fluxo de F-actina via análise STICS ¹² e serviria para pesquisadores que desejam determinar o fluxo molecular bidimensional em células vivas, a partir de dados adquiridos em resoluções espaciais para além do limite de difração da luz.