Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
Filamentosa-actina gioca un ruolo cruciale nella maggioranza dei processi cellulari tra cui motilità e, in cellule immunitarie, la formazione di una interazione cellula-cellula chiave noto come sinapsi immunologica. F-actina è anche ipotizzato a svolgere un ruolo nella regolazione distribuzioni molecolari alla membrana delle cellule tra cui dinamiche vescicole sub-membranoso e proteine clustering. Mentre le tecniche microscopio ottico standard, consentono osservazioni generalizzate e diffrazione limitata da apportare, molti eventi cellulari e molecolari, tra cui il clustering e il flusso molecolare si verificano in popolazioni a lunghezza scale molto al di sotto del potere risolutivo di microscopia ottica standard. Combinando riflessione interna totale fluorescenza con la super Resolution Imaging metodo strutturato illuminazione microscopia, il flusso molecolare bidimensionale di F-actina alla sinapsi immune delle cellule T è stato registrato. Spettroscopia spazio-temporale dell'immagine correlazione (STIC) è stato poi applicato, che genera Resul quantificabilits in forma di istogrammi di velocità e mappe vettoriali rappresentanti direzionalità del flusso e la grandezza. Questo protocollo descrive la combinazione di tecniche di imaging e racchette super-risoluzione per generare vettori di flusso a livello sub-diffrazione di dettaglio. Questa tecnica è stata utilizzata per confermare un flusso actina che è simmetricamente retrogrado e centripeta tutta la periferia delle cellule T sulla formazione di sinapsi.
Introduction
L'obiettivo di questo esperimento è all'immagine e caratterizzare il flusso molecolare di filamentous- (F-) actina in cellule viventi T, oltre il limite di diffrazione per stabilire la direzione del flusso e della portata durante sinapsi immunologica (IS) formazione. Questa tecnica sarà effettuata utilizzando un microscopio illuminazione strutturata (SIM) in modalità riflessione totale fluorescenza interna (TIRF), l'imaging Jurkat cellule T costituiscono sinapsi artificiale sull'attivazione vetrini rivestiti di anti-CD3- ed anticorpi anti-CD28. Le forme si trova tra una cellula T e il suo obiettivo; una cellula che presenta l'antigene (APC) sul recettore delle cellule T (TCR) di attivazione 1,2. Poiché questo è il primo passo per determinare se il sistema immunitario adattativo genera una risposta immunitaria ad una infezione, le conseguenze di risposta agli stimoli non corretto può causare una serie di malattie. L'importanza dell'interazione cellule T-APC è ben documentata, tuttavia, il ruolo (s) del maturo è dopo TCR si inizialeinternalizzazione de segnal devono ancora essere pienamente compreso.
Poiché il citoscheletro è pensato per aiutare due processi legati all'attivazione TCR (il movimento delle molecole sulla membrana plasmatica ed il controllo di molecole di segnalazione dipendenti dal citoscheletro actina 3,4), comprendere come il citoscheletro riorganizza spazialmente e temporalmente delucideranno gradini di riorganizzazione molecolare durante la formazione delle sinapsi. Il flusso retrogrado di F-actina è pensato per corral cluster TCR verso il centro della sinapsi immunologica, questa traslocazione si crede di essere di vitale importanza per la cessazione del segnale e il riciclaggio; favorendo il delicato equilibrio di attivazione delle cellule T 5.
Mentre un microscopio a fluorescenza è uno strumento flessibile che continua a fornire indicazioni su molti eventi biologici comprese le interazioni cellula-cellula, è limitata dalla capacità del sistema di risolvere con precisione più fluorofori che risiedono vicino di quanto il diffrLimite di azione (≈200 nm) l'uno dall'altro. Come molti eventi molecolari all'interno delle cellule coinvolgono popolazioni dense di molecole e mostrano riassetto dinamico sia in quiescenza o in seguito a stimolazione specifica, microscopia ottica convenzionale non fornisce il quadro completo.
L'uso di super risoluzione delle immagini ha permesso ai ricercatori di aggirare il limite di diffrazione usando una varietà di tecniche. Microscopia localizzazione molecola singola (SMLM) come Palm e STORM 6,7 ha la capacità di risolvere la posizione di molecole fino a una precisione di circa 20 nm, tuttavia, queste tecniche contare su lunghi tempi di acquisizione, costruire un'immagine di numerose cornici . In genere questo richiede campioni da fisso o per le strutture di esporre scarsa mobilità in modo singole fluorofori non sono male interpretato come più punti. Mentre esaurimento emissione stimolata (STED) di imaging consente super-risoluzione attraverso molto selettivo confocale eccitazione 8, la scansione richiestaapproccio può essere lento su campi di cellule intere di vista. STED dimostra anche fototossicità significativo per risoluzioni più elevate a causa dell'aumento della potenza del fascio esaurimento.
Structured microscopia illuminazione (SIM 9) fornisce un'alternativa a questi metodi, in grado di raddoppiare la risoluzione di un microscopio a fluorescenza standard ed è più compatibile con cellule vive rispetto alle tecniche attuali SMLM. Esso utilizza potenze laser inferiori, in un sistema a grande campo per i campi di cellule intere di vista; fornire una maggiore velocità di acquisizione, ed è compatibile con l'etichettatura fluoroforo standard. La natura a grande campo di SIM permette anche l'utilizzo di totale fluorescenza riflessione interna (TIRF) per l'eccitazione altamente selettiva, con profondità di penetrazione nella dimensione assiale di <100 nm.
Spettroscopia di correlazione immagine (ICS) è un metodo di correlare fluttuazioni di intensità di fluorescenza. Un'evoluzione di ICS; Im spazio-temporalespettroscopia di correlazione età (STIC 10) correla segnali fluorescenti intracellulari nel tempo e nello spazio. Correlando intensità dei pixel con pixel circostanti in cornici in ritardo di sviluppo tramite una funzione di correlazione, le informazioni si ottiene quanto concerne la velocità di flusso e direzionalità. Per assicurare oggetti statici non interferiscono con l'analisi STICS, un filtro oggetto immobile viene implementato, che funziona sottraendo una media mobile delle intensità dei pixel.
La tecnica qui presentata si crede di essere la prima dimostrazione della spettroscopia di correlazione immagine che viene applicata ai dati microscopia super-risoluzione per quantificare il flusso molecolare in cellule vive 11. Questo metodo migliora sull'imaging diffrazione limitata di flusso F-actina tramite STICS analisi 12 e sarebbe adatto ricercatori che desiderano per determinare il flusso molecolare bidimensionale in cellule vive, dai dati acquisiti a risoluzioni spaziali oltre il limite di diffrazione della luce.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa tecnica permetterà ai ricercatori di immagine e quantificare precedentemente dettagli irrisolvibili in cellule che esprimono fluorescenza. Nei nostri risultati ci mostrano che F-actina scorre in modo simmetrico dalla periferia verso il centro cella di cella nella cella di T IS. Questi risultati sono in linea con le precedenti risultati di linea 1D dati del profilo chimografo 13 ed estendere la capacità di analisi dei dati super-risoluzione 2D e.
La tecnica presentata è u…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
Referencias
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
