קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

מטרת הניסוי היא תמונה ומאפיין את הזרימה המולקולרית של filamentous- אקטין (F-) בתאים חיים T, שחורגת ממגבלת העקיפה כדי להקים זרימת כיוון ועצמה במהלך סינפסה החיסונית (IS) היווצרות. טכניקה זו תבוצע באמצעות מיקרוסקופ מובנה תאורה (SIM) במצב הקרינה השתקפות פנימית (TIRF) כולל, הדמיה Jurkat תאי T יוצרים סינפסה מלאכותית על הפעלת coverslips מצופה אנטי-CD3- ונוגדנים נגד CD28. הצורות היא בין תא T והיעד שלה; תא הצגת אנטיגן (APC) על קולטן תא T ^1,2 הפעלה (TCR). כמו זה הוא הצעד הראשון בקביעה האם המערכת החיסונית אדפטיבית יוצרת תגובה חיסונית לזיהום, את ההשלכות של היענות לגירויים נכונה יכולות לגרום למספר המחלות. החשיבות של האינטראקציה התא T-APC מתועדת היטב, לעומת זאת, התפקיד (ים) של הבוגר הוא לאחר סי TCR הראשוניתהפנמת gnal הם עדיין לא הבינו באופן מלא.

כחשב שלד התא כדי לסייע שני תהליכים הקשורים להפעלת TCR (התנועה של מולקולות בקרום הפלזמה והשליטה של מולקולות איתות תלויות ביקטין שלד תא ^3,4), הבנה כיצד שלד התא מארגן מחדש מרחב ובזמן יבהיר את הצעדים של ארגון מחדש מולקולרי במהלך היווצרות סינפסה. הוא חשב זרימת מדרדר של F- אקטין לכלוא אשכולות TCR לכיוון מרכז סינפסה החיסונית, הוא האמין טרנסלוקציה זה להיות חיוני להפסקת אות ומחזור; סיוע לאיזון העדין של הפעלת תא T ^5.

בעוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי הסטנדרטי הוא כלי גמיש שממשיך לספק תובנה על אירועים ביולוגיים רבים, כולל אינטראקציות תא-תא, הוא מוגבל על ידי היכולת של המערכת כדי לפתור במדויק fluorophores מרובה המתגורר קרוב יותר מdiffrמגבלת פעולה (≈200 ננומטר) של אחד את השני. אירועים מולקולריים רבים בתוך תאים כרוכים אוכלוסיות צפופות של מולקולות ולהציג סידור דינמי או בקפאון או על גירוי מסוים, מיקרוסקופ אור הרגילה אינה מספקת את התמונה המלאה.

השימוש בהדמיה ברזולוציה סופר אפשר לחוקרים לעקוף את מגבלת העקיפה תוך שימוש במגוון של טכניקות. מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת (SMLM) כגון PALM ^ו6,7 STORM יש את היכולת לפתור את המיקום של מולקולות עד דיוק של כ -20 ננומטר, לעומת זאת, טכניקות אלה מסתמכים על פי רכישה ארוכה, בניית תמונה על מסגרות רבות . בדרך כלל זה דורש דגימות להיות קבועים או למבנים להציג ניידות נמוכה fluorophores כך בודדת לא כהלכה כמספר רב של נקודות. בעוד דלדול פליטה מאולץ (STED) הדמיה מאפשרת רזולוציה סופר דרך עירור confocal מאוד סלקטיבית ^8, הסריקה הנדרשתגישה יכולה להיות איטית מעל שדות תא כל מבט. STED גם מדגים phototoxicity המשמעותי לרזולוציות גבוהות יותר כתוצאה מהעלייה בכוחה של קרן הדלדול.

מיקרוסקופיה תאורה המובנה (SIM ⁹⁾ מספקת אלטרנטיבה לשיטות אלה, מסוגלים להכפיל את הרזולוציה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי והוא תואם יותר עם ​​הדמיה תא חי מטכניקות SMLM הנוכחיות. היא משתמשת בסמכויות לייזר נמוכות, במערכת רחבה בתחום לשדות כל תא מבט; מיועד לספק מוגבר במהירויות רכישה, והוא תואם עם תיוג fluorophore סטנדרטי. הטבע רחב בתחום של SIM גם מאפשר הניצול של הקרינה הכוללת הפנימית השתקפות (TIRF) לעירור סלקטיבית, עם עומק חדירה בממד הצירי של <100 ננומטר.

ספקטרוסקופיה מתאם תמונה (ICS) היא שיטה של ​​correlating תנודות בעוצמת הקרינה. אבולוציה של ICS; im מרחב ובזמןספקטרוסקופיה מתאם גיל (מאפיינים אילו ¹⁰⁾ קורלציה אותות ניאון תאיים בזמן ובמרחב. באמצעות התאמת עוצמות פיקסל עם סובבי פיקסלים במסגרות מפגרת באמצעות פונקציית מתאם, מידע צבר לגבי זרימת מהירויות ויווניות. כדי להבטיח אובייקטים סטטיים לא להפריע לניתוח המאפיינים אילו, מסנן אובייקט נייח מיושם, אשר עובד על ידי הפחתת ממוצע נע של עוצמות פיקסל.

הוא האמין הטכניקה המוצגת כאן להיות ההפגנה הראשונה של ספקטרוסקופיה מתאם תמונה מיושמת לנתונים במיקרוסקופ ברזולוציה הסופר לכמת את הזרימה המולקולרית בתאים חיים ^11. שיטה זו משפרת בהדמיה עקיפה המוגבל של זרימת F- אקטין באמצעות ניתוח המאפיינים אילו ¹² ותתאים חוקרים שרוצים לקבוע זרימה מולקולרית דו-ממדית בתאים חיים, מנתונים שנרכשו ברזולוציות מרחבי שמעבר לגבול השתברות אור.