Een Magnetic Microbead occlusie Model voor het induceren van oculaire hypertensie-Dependent Glaucoom in Muizen

De volgende procedure werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care voor het gebruik van proefdieren en de verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Visual Uit onderzoek van de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde (ARVO). 1. Voorbereiding van de Microneedle voor anterieure intracamerale Injection Met een trekker, het genereren van een micronaald van een borosilicaatglas capillair Onder een microscoop met een scherp mes zorgvuldig maak een opening aan de punt van de micronaald. De resulterende gat moet een elliptische vorm met een hoofd- en nevenas diameter van ongeveer 190 urn en 70 urn respectievelijk. Meet het oppervlak van de bereide micronaald opening door eerst ophalen van afbeeldingen met een liniaal onder de microscoop gevolgd door kwantificering behulp van beeldanalyse software geplaatst. In de micropipet afschuining systeem, plaatst u de microneedle bij een 20 degree hoek ten opzichte van de afschuining plaat, zodat de microneedle opening de plaat raakt. Bevel gedurende ongeveer 10 minuten totdat de randen zijn vlak en glad. Voeg een paar druppels gedestilleerd water om te helpen bij het proces. Draai de microneedle om de twee randen rondom de opening totdat de tip is scherp bevel. Maak alle puin en water uit de microneedle tip opening met behulp van een spuitbus stofdoek. Zorgvuldig onderzoek van de afgewerkte microneedle onder een microscoop. Ontdoen micronaalden met breuken het risico van het breken micronaald minimaliseren tijdens de operatie. Steriliseer de micronaald door eerst spoelen met ethanol, daarna met steriele gebalanceerde zoutoplossing (BSS). 2. Voorbereiding van de Magnetic Microbead Solution Opmerking: De magnetische microkralen die in deze studie zijn gecoat met epoxygroepen. Om eventuele nadelige effecten, zoals klonteren van de kralen en ongewenste moleculaire interacties te voorkomen, moeten deze epoxygroepeneerst worden verwijderd uit de microkralen alvorens de injectie operatie. Verwijdering van Epoxy groepen van Magnetic Beads Bereid een oplossing van 0,02 M natriumhydroxide (NaOH, MW 39,997 g / mol) in 10 x Tris buffer (MW 121,14 g / mol). Voorzichtig vortex de voorraad microkorrel magnetische oplossing (4,5 urn diameter, 4 x 10 8 kralen / ml) totdat de korrels gelijkmatig gesuspendeerd in oplossing. Snel Pipetteer 1 ml van magnetische bead oplossing in 50 ml 0,02 M NaOH in 10 x Tris buffer. Draai gedurende 24 uur bij KT om de epoxygroepen van de bolletjes te verwijderen. Verzamel de kralen door het bevestigen van een magneet om de bodem van de buis. Oriënteren de buis horizontaal zodat alle korrels worden aangetrokken door de magneet. Roteren tegen 4 uur bij KT. Met een micropipet voorzichtig het supernatant te verwijderen zonder de pellet te verstoren kralen. Voorzichtig vortex de pellet in 50 ml van 10x Tris buffer totdat de kralen goed zijn opgehangen. Herhaal de stappen 2.1.4 tot 2.1.6. Concentratie en de resuspensie van Magnetic Microkralen in steriele Balanced Salt Solution Opmerking: Het is noodzakelijk om de voorraad van magnetische bolletje oplossing in steriele gebalanceerde zoutoplossing (BSS) concentreer tot een eindconcentratie van 1,6 x 10 6 kralen / ul bereikt zodat 2,4 x 10 6 kralen in de voorste kamer kan worden geïnjecteerd in een eindvolume van 1,5 pl, die geschikt is voor kleine muis oog. Was de kralen in 5 ml ultrazuiver water laboratoriumkwaliteit door voorzichtig vortexen gedurende 2 min. Verzamel de kralen door ze te lokken naar de bodem van de buis met een magneet. Met een micropipet, voorzichtig het water te verwijderen zonder de pellet van kralen te verstoren. Herhaal de stappen 2.2.1 tot 2.2.3 nog drie keer. In een laminaire stroming kap, was de kralen met 500 pi van BSS door pipetting op en neer. Voer de overige stappen van deze afdeling onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. Verzamel de kralen door ze te lokken naar de bodem van de buis met een magneet. Met een micropipet, voorzichtig de BSS te verwijderen zonder de pellet van kralen te verstoren. Herhaal de stappen 2.2.5 tot 2.2.7 nog drie keer. Resuspendeer de kralen door pipetteren en neer in 250 pl BSS. Zorg ervoor dat de kraal oplossing is goed gehomogeniseerd. Vervolgens snel aliquot 25 ul van de suspensie in steriele 0,5 ml buizen. De uiteindelijke concentratie van de voorraad kraal oplossing is 1,6 x 10 6 kralen / ul. Bewaren bij 4 ° C. 3. Inductie van oculaire hypertensie Let op: Deel 3 is een twee-persoons bediening. Indien een bepaalde actie moet worden uitgevoerd door een bepaalde persoon, wordt de juiste persoon geïdentificeerd. In het algemeen Persoon 1 verzorgt de muis onder de microscoop tijdens Person 2 rresponsabilisering voor het manipuleren van de micro-pomp. De totale duur van de chirurgische procedure moet minder dan 10 min (stappen 3,9-3,17). Werkzaamheden uitvoert bij volwassen C57BL / 6-muizen. Huis muizen in een standaard omgeving met toegang tot voedsel en water ad libitum. In dit artikel gebruiken vrouwelijke C57BL / 6 muizen tussen de 3 en 4,5 maanden oud. Dit kan echter worden aangepast protocol mannetjes en muizen van verschillende leeftijden, evenals andere muizenstammen, waaronder transgene en knockout muizen. Meet de basislijn IOP in wakkere muizen voorafgaand aan de anesthesie en microbead injectie met behulp van een gekalibreerde rebound tonometer. Breng een druppel proparacaïne hydrochloride op het hoornvlies. Voorzichtig weerhouden de muis door het houden van de huid tussen de oren. Plaats de muis in de stationaire zodat het dier comfortabel en de ogen zijn toegankelijk. Houd de tonometer loodrecht op het corneale oppervlak en neemt ten minste drie reeksen van tien opeenvolgende aflezingen per oog wordt verkregen waarvanIOP gemiddelde. Het meten van IOP wakkere muizen voorkeur anesthesiegerelateerde effecten op IOP omzeilen. Als alternatief kan IOP worden gemeten in verdoofde muizen na stap 3.4. Bereid een voorraad muis cocktail verdoving mengsel van 20 mg / ml ketamine, 2 mg / ml xylazine en 0,4 mg / ml acepromazine. Anesthesie induceren bij muizen door intraperitoneale toediening van de cocktail mengsel (1 ul / g lichaamsgewicht). Het gebruik van een injecteerbaar anestheticum cocktail voorkeur boven gas anesthetica (bijvoorbeeld isofluraan), omdat het zorgt voor flexibiliteit bij het ​​hanteren van de muis hoofd als het dier niet is aangesloten op een inhalatiemasker. Bovendien is de langere termijn herstel vereist met een injecteerbare verdoving zorgt ervoor dat microbolletjes vestigen op de iridocorneale hoek zonder loskomen terug in de voorste kamer. Dien 0,05 mg per kg lichaamsgewicht subcutaan buprenorfine. Behandel het oog met een tropicamide eye dalen tot pupilverwijding induceren. Vanwege de kleine afmetingen van het muizen voorste kamer, moet de pupil gedilateerd om gemakkelijk te visualiseren de positionering en de vooruitgang van de micronaald gedurende de injectie. Toepassen topische zalf op het contralaterale oog (vn bediend) om uitdroging van het hoornvlies tijdens de procedure te voorkomen. Bevestig een schone microneedle aan de injectie assemblage van de micro-pomp. Vervang de microneedle na elke operatie om verontreiniging cross-dier te voorkomen. Persoon 1: Breng de verdoofd muis om de operationele platform. Onder de microscoop, opdat de pupil volledig verwijd en dat de oculaire spieren ontspannen zodat er geen oogbeweging. De afwezigheid van oogbewegingen zorgt voor stabiliteit tijdens de injectie. Veeg het tropicamide oogdruppels uit het oog met behulp van absorberende swabs. Persoon 2: Meng de magnetische microbead oplossing door en neer te pipetteren. Met behulp van de micro-pomp, onmiddellijk de MICR ladenoneedle (opgesteld in paragraaf 1) met 1,5 ul van het gehomogeniseerde magnetische microbead-oplossing (2,4 x 10 6 bolletjes). Zorg ervoor dat de luchtbellen afwezig zijn op het puntje van de microneedle. Nadat de micronaald is geladen, voert stap 3,12-3,13 zo snel mogelijk, zodat de magnetische microbead oplossing in een homogene suspensie blijft. Plaats de micronaald geladen op een 45 ° hoek geplaatst ventraal ten opzichte van de limbus. Persoon 1: ondersteuning van het oog met behulp van plastic tang. Waarborgen dat de hoek tussen de micronaald en de plastic tang ongeveer 90 °. Persoon 2: Met geladen micronaald voorzichtig doorboren de cornea, zodat de punt van de micronaald komt in de voorste kamer. Controleer of de geladen micronaald blijft een 45 ° hoek ten opzichte van de limbus tijdens de punctie. Vermijd elk contact met de lens of de iris. Zorg ervoor dat de microneedle de achterste kamer niet in te voeren. Persoon 1: doorgaan met het oog ondersteunenkunststofleidingen pincet. Persoon 1: Zonder de muis hoofd plaatst de magneet naast het oog, tegenover de micronaald tip, de magnetische korrels in de voorste kamer te trekken en contact van de bolletjes met het binnenoppervlak van de cornea te minimaliseren. Persoon 2: De injectiespuit pomp, injecteer 1,5 ul van het magnetische bolletje oplossing in de voorste kamer. De microbead oplossing wordt geïnjecteerd over een periode van 15 tot 30 sec. Persoon 1: Blijf de magneet tegenover de microneedle tip tijdens de gehele duur van de injectie te houden. Persoon 2: Zodra de volledige omvang van de kralen is geïnjecteerd, langzaam terug te trekken van de microneedle uit het oog. Persoon 1: oprisping van de microkralen voorkomen, blijven de magnetische korrels naar de voorste kamer te trekken door de magneet naast het oog gedurende 30 60 sec. Persoon 1: Met behulp van de magneet, het aantrekken van de kralen om de iridocorneale hoek. Zorg ervoor dat de kralen vormen een gelijkmatig verdeelde ringrond de omtrek van de voorste kamer. Tijdens deze stap vermijden kralen om de cornea als ze de neiging hebben om zich aan de binnenzijde van het hoornvlies bij contact. Behandel het geopereerde oog met antibiotische oogdruppel om het risico op infectie. Laat de muis om te herstellen op een warmte-pad, totdat helemaal wakker (~ 3-4 uur). Plaats de muis, zodat de geopereerde oog naar boven wordt geconfronteerd. Deze positionering wordt ophoping van de geïnjecteerde korrels voorkomen dat het binnenoppervlak van het hoornvlies door zwaartekracht. Daarnaast zal deze positie de kans op infectie van de geopereerde oog niet in contact komt met bedden en / of andere materialen die in de kooi kan afnemen. Indien een dier toont tekenen van leed toedienen bijkomende doses van buprenorfine zoals nodig. Sta muizen te herstellen van de procedure minstens 2 dagen alvorens IOP metingen. Meet IOP zoals beschreven in 3.2. Monitor IOP ten minste eenmaal per week of vaker indien nodig, en op hetzelfde tijdstip van de dag circadiane-fluctuaties te minimaliseren. Voor IOP metingen, gebruik dan de contralaterale oog van de geopereerde muis als een interne controle. U kunt ook gebruik maken van metingen van intact, niet-bediend of schijn-geopereerde muizen als naïeve controles. 4. Beoordeling van retinale ganglioncel Soma en Axon Survival Perfuseren muizen blootgesteld aan oculaire hypertensie door intracardiale injectie van 0,1 M fosfaatbufferoplossing (PBS) direct gevolgd door ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA). Perfuseren intact, niet-geopereerde muizen, zoals beschreven in 4.1 en gebruik ze als ongedeerd controles. Het gebruik van contralaterale ogen uit bediend muizen is niet aan te raden om RGC overleven beoordelen, omdat veranderingen in de contralaterale ogen na letsel gemeld 15,16 en kan data interpretatie verwarren. Als alternatief gebruik schijn-geopereerde ogen geïnjecteerd met 10,5 gl BSS als controles. Gebruik microscissors voorzichtig snijd het bindweefsel rond het oog waarmee het van de oogkas. Scheid de optische zenuw van het oog door te snijden ter hoogte van de oogzenuw. Met een 30 G naald, een gat in het hoornvlies om penetratie van het fixeermiddel oplossing in het oog mogelijk. Plaats het oog in 4% PFA en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C voor extra fixatie. Plaats de oogzenuw in een oplossing die 2% PFA en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacodylaat (MW: 214 g / mol) en geïncubeerd O / N bij 4 ° C voor extra fixatie. 5. Kwantificering van RGC Soma Density op Flat-gemonteerde netvliezen Opmerking: De volgende procedure is een bewerking van een protocol door Nadal-Nicolas et al 17 en schetst de kwantificering van RGC met behulp van een antilichaam tegen de hersenen specifieke homeobox / POU-domein eiwit 3A (Brn3a) op het netvlies flatscreen-mounts.. alternatieve methods voor etikettering RGC kan ook worden gebruikt, waaronder immunohistochemie met een antilichaam tegen RNA-bindend eiwit met meerdere splicing (RBPMS) of retrograde labeling met Fluorogold of DII. Onder een stereomicroscoop, verwijder het voorste deel van het oog door een incisie over de gehele limbus tot het hoornvlies gemakkelijk loskomt. Verwijder het hoornvlies en lens. Haal voorzichtig het netvlies van het oog door het maken van sneden langs de ora serrata en de oogzenuw. Bereid een retinale flat-mount door vier kleine incisies op gelijke afstand van de omtrek van de retina naar de oogzenuw om duidelijk af te bakenen de vier kwadranten van het netvlies. Met behulp van een kleine borstel, verwijder voorzichtig alle resterende glasvocht van het netvlies. De verwijdering van zoveel mogelijk glasvocht mogelijk cruciaal voor het verkrijgen van een schone en sterke immunohistochemische signaal. overdracht van de retina voorzichtig een 48 putjes met vlakke bodem kweekplaat met 0,5% Triton X-100 in PBS zodat het netvliesvrij zwevende. Zorg ervoor dat de ganglion cellaag naar boven is gericht. Plaats de petrischaal bij -70 ° C gedurende 15 minuten. Na ontdooien het netvlies, verder permeabilize door tweemaal wassen in vers 2% Triton X-100 in PBS. Verdun de Brn3a antilichaam 0,3-0,5 ug / ml met PBS dat 2% Triton X-100 en 2% normaal serum ezel. Incubeer de retina in het Brn3a primaire antilichaamoplossing door voorzichtig schudden O / N bij 4 ° C. Het netvlies moet volledig ondergedompeld in 150 tot 200 gl oplossing op elk moment. Verdun de ezel anti-geit IgG secundair antilichaam tot 2 ug / ml met PBS dat 2% Triton X-100 en incubeer het netvlies in deze oplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Het netvlies moet volledig ondergedompeld in de antilichaamoplossing allen tijde. Bedek de cultuur plaat met aluminiumfolie voor de resterende stappen om fotobleken te voorkomen. Met behulp van een borstel, zorgvuldig het netvlies over te dragen aan een dia, zodat het weefsel ligt zo plat als poslijk. Drogen aan de lucht gedurende 10 minuten. Monteer met behulp van anti-fade montage medium. Bestudeer de retinale flat-mounts onder een fluorescentiemicroscoop. Kwantificeren van het aantal Brn3a positieve RGC in drie niet-overlappende gebieden per retinale kwadrant zoals beschreven. 18 6. Kwantificering van RGC Axonen op Optic Nerve Dwarsdoorsneden Verzamel de oogzenuw uit stap 4.5 en incubeer in 2% osmiumtetroxide (OsO 4, MW 254,23 g / mol) gedurende 2 uur. Let op: Vanwege de hoge toxiciteit, osmiumtetroxide moet worden in een zuurkast met adequate laboratorium kledij behandeld. Uitdrogen de oogzenuw door onderdompeling in toenemende concentraties ethanol (50%, 70%, 90%, 95% en 100%) gedurende 15 minuten elk. Bereid de epoxyhars met het volgende recept: 15,72 ml insluiten-812, 6,45 ml dodecenylbarnsteenzuuranhydride, 7,83 ml methyl nadinezuur anhydride, 0,45 ml DMP-30. Opeenvolgend uitbroeden de oogzenuw in oplossingen bestaandevan de volgende verhoudingen van epoxyhars naar propyleenoxide (MW 58,08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25 en 1: 0. De oogzenuw wordt geïncubeerd in elke oplossing bij kamertemperatuur een O / N periode. Incubeer optische zenuwen ingesloten in 100% epoxyhars (laatste stap van 6,4) bij 60 ° C gedurende nog 48 uur. Genereer semi-dunne optische zenuw dwarsdoorsneden (0,75 pm) met behulp van een microtoom. Vlek oogzenuw doorsneden met 1% toluidine blauw. Kwantificeren van de RGC axonen in vijf niet-overlappende gebieden van elke oogzenuw sectie zoals beschreven 19.