A磁条微珠缺血模型，以诱导小鼠高眼压，青光眼相关

下面的程序是符合加拿大议会关于动物饲养对实验动物的使用以及在视觉与眼科（ARVO）眼科使用动物及视觉研究从研究协会声明的指导方针进行。 1.微针的制备前房内注射带拉出器，生成从硼硅玻璃毛细管的微针在显微镜下，用锋利的刀片，以精心打造的微针尖端的开口。所得开口应具有约190微米和70微米的长轴和短轴直径为椭圆形，分别。测量所制备的微针开口由第一获取图像与显微镜利用图像分析软件，随后通过定量下置于一个标尺的面积。 在微量斜边系统，将微针在20 degre相对角度E要斜切板，使微针开口接触到板。斜角为大约10分钟，直到边缘是平的，光滑的。加蒸馏水几滴在过程中提供帮助。 旋转微针斜角围绕开口，直到提示是尖锐的两条边。 清洁所有碎片和水使用喷雾剂掸子微针末端开口。 仔细检查在显微镜下完成的微针。骨折丢弃微针在手术过程中，以尽量减少微针断裂的风险。 用乙醇漂洗，然后用无菌平衡盐溶液（BSS）消毒微针。 2.磁性微珠溶液的制备注意：在此研究中使用的磁微珠涂覆有环氧基。为了防止任何不利的影响，如珠粒结块和不需要的分子间的相互作用，这些环氧基必须首先从微珠与注射手术操作前除去。 从磁珠环氧基团的去除 制备的0.02M氢氧化钠（NaOH，MW39.997克/摩尔）在10倍的Tris缓冲液中的溶液（MW121.14克/摩尔）。 轻轻涡旋磁微珠溶液的股票（直径4.5微米，4×10 8珠/ ml）的，直到珠粒均匀悬浮在溶液中。 迅速吸取1毫升磁珠溶液到50ml的0.02M NaOH的10×Tris缓冲液。 旋转在RT 24小时，从珠除去环氧基。 用磁铁固定到管的底部收集珠。水平定向管，以确保所有的珠被吸引到磁铁。旋转在室温额外的4小时。 随着微管，小心地取出上清而不干扰珠沉淀。 轻轻涡旋沉淀在50毫升10X的TRIS缓冲区，直到珠以及暂停。 重复步骤2.1.4至2.1.6。 浓度和在无菌平衡盐溶液磁微珠的重悬 注意：有必要集中在无菌平衡盐溶液（BSS）磁珠溶液的库存达到1.6×10 6珠/微升的最终浓度，使2.4×10 6珠可在注射入前房1.5微升，这是适合于小鼠眼的最终体积。 通过2分钟轻轻涡旋洗珠在5ml超纯水实验室级水。 通过吸引他们与磁铁的管底部收集珠。 随着微管，小心地取出水，无干扰的珠沉淀。 重复步骤2.2.1至2.2.3三次。 在层流罩，洗珠用500μlBSS由pipettin克上下。执行在层流罩无菌条件下，本节剩下的步骤。 通过吸引他们与磁铁的管底部收集珠。 随着微管，小心地取出BSS不干扰珠子的沉淀。 重复步骤2.2.5至2.2.7三次。 通过上，在250微升BSS的上下吹吸珠悬浮。 确保该珠子溶液是良好均化。然后，迅速分装25微升悬浮液进入无菌0.5毫升管。股票珠溶液的最终浓度为1.6×10 6珠/微升。 保存在4℃。 3.高眼压的诱导注：第3节是两个人的操作。在一个特定的操作是由一个特定的人执行的情况下，适当的人被识别。一般情况下，1人负责处理在显微镜下鼠标，而人2为responsible用于操纵微量注射泵。手术过程的总持续时间应少于10分钟（步骤3.9至3.17）。 在成年C57BL / 6小鼠进行的程序。家鼠与获得食物和水随意的标准环境。在本文中，使用3和4.5个月的年龄之间的雌性C57BL / 6小鼠。然而，该协议可以适应男性和不同年龄的小鼠，以及其它小鼠品系，包括转基因和基因敲除小鼠。 使用校准反弹眼压计测量麻醉和微珠注射前清醒小鼠基线眼压。应用角膜盐酸丙美卡因一滴。 按住两耳之间的皮肤轻轻地抑制鼠标。放置在台式鼠标，使得动物的舒适和眼睛是可访问的。持张力计垂直于角膜表面，并采取至少三组连续10次读数每眼，得到眼压平均水平。眼压清醒小鼠的测量最好绕过IOP麻醉相关的影响。可替代地，眼压可以在anesthetised小鼠步骤3.4之后测量。 制备的20毫克/毫升氯胺酮，2毫克/毫升赛拉嗪，和0.4毫克/毫升乙酰丙嗪组成的库存鼠标鸡尾酒麻醉混合物。 由鸡尾酒混合物（1微升/ g体重的）的腹腔内给药诱发小鼠麻醉。利用可注射的麻醉剂鸡尾酒优于气体麻醉剂（ 例如，异氟烷），因为它允许灵活处理鼠标头时作为动物是未连接到吸入面罩。此外，可注射的麻醉剂需要较长的恢复期确保微珠在虹膜角膜角沉降而不撞出回进入前房。 辖0.05毫克每公斤体重丁丙诺啡皮下公斤。 治疗眼睛有托EYË下降诱发瞳孔扩大。由于鼠前房的小尺寸，瞳孔必须散瞳在注射过程中很容易地显现微针的定位和进步。 在对侧眼（未操作）适用外用药膏，以避免在操作过程中的角膜的干燥。 附加一个干净的微针的微量注射泵的喷射组件。每次操作后，更换微针，避免交叉污染的动物。 人1：anesthetised鼠标传送到操作平台。在显微镜下，确保瞳孔充分散瞳和眼部肌肉放松，这样就没有眼球运动。没有眼睛运动的注射过程中确保稳定。轻轻擦拭使用吸水擦拭眼周托吡卡胺滴眼液。 人2：通过上下吹打混匀磁微珠溶液。 使用微量注射泵，立即加载MICRoneedle 1.5微升均质磁微珠溶液（2.4×10 6珠）的（在第1制备）。确保气泡在微针的尖端不存在。微针被加载后，开展尽快步骤3.12 3.13使磁性微珠溶液保持在均匀的悬浮液。 在45°角的装微针，前方相对放置在角膜缘定位。人1：支持使用塑料镊子的眼睛。确保微针和塑料镊子之间的角度是大约90°。 人2：随着装微针，使微针的尖端进入前房轻轻穿刺角膜。确保装入微针保持在相对于45°角的角膜缘穿刺期间。避免镜头或虹膜任何接触。确保微针不进入后房。人1：继续支持眼睛使用塑料镊子。 人1：无移动鼠标头，放置磁铁眼睛旁边，相对的微针尖端，以吸引磁珠进入前房，并尽量减少与角膜的内表面的珠接触。人2：使用微量注射泵，注射1.5微升磁珠溶液进入前房。微珠溶液注入历时15至30秒的。人1：继续注射的整个持续时间期间保持所述磁体相对的微针尖端。 人2：一旦珠的全部体积已经注入，慢慢撤出从眼睛的微针。人1：为了避免微珠回流，继续保持旁边的眼磁铁另外30至60秒，以吸引朝向前房磁珠。 人1：使用磁铁，吸引珠的虹膜角膜角。确保珠形成一个均匀分布的环围绕前房的周长。在此步骤中，避免吸引小珠的角膜，因为他们必须坚持在接触角膜的内表面上的倾向。 治疗所操作的眼用抗生素滴眼剂以减少感染的风险。 让鼠标在隔热垫恢复，直到完全清醒（〜3至4小时）。将鼠标，使得操作眼朝上。这种定位将防止注入的珠粒积累由引力角膜的内表面上。此外，该位置将减少感染的操作眼将不会与任何被褥和/或可以存在于所述笼的其它材料接触的可能性。在动物遇险显示任何征兆的情况下，需要额外的管理剂量丁丙诺啡。 允许小鼠从程序取眼压测量之前恢复至少2天。在3.2中所述测量眼压。莫尼器眼压至少每周一次或更频繁，如需要的话，并在一天的同一时间，以减少昼夜相关的波动。 眼压测量，使用对侧眼从操作鼠标作为内部对照。另外，使用来自完好，无操作或假手术小鼠为幼稚控制测量。 4.视网膜评估神经节细胞索玛和轴突生存灌注通过的0.1M磷酸盐缓冲液（PBS）然后立即冰冷的4％多聚甲醛（PFA）心脏内注射进行眼压的小鼠。 灌注完好，非手术小鼠为4.1，并且使用它们作为未受伤的控制。不推荐使用从手术小鼠对侧眼睛，因为受伤后的变化对侧眼睛已经报15,16，可以混淆数据解释，以评估RGC存活。另外，使用假手术的眼睛注射10.5微升的BSS作为对照。 使用microscissors，精心裁剪结缔组织眼部周围，将其从眼窝隔离。通过在视神经乳头的水平切割其分离从眼视神经。 使用地下30针，使一个孔中的角膜，以允许固定剂溶液到眼睛中的渗透。将眼睛在4％PFA，在4℃孵育1小时额外的固定。 放置视神经在含有2％的PFA和在0.1M二甲胂酸钠2.5％戊二醛溶液（MW 214克/摩尔）和孵育O / N，在4℃再固定。 5. RGC索玛密度对量化平置式视网膜 注意 ：以下过程是由纳达尔，尼古拉斯等[17]的协议适配，并概述使用对脑特异性同源盒/ POU域蛋白3A（Brn3a）对视网膜平板支架的抗体视网膜神经节细胞的量化。替代甲基用于标记的RGC ODS也可以使用包括与针对具有多个剪接（RBPMS）或逆行标记用荧光金或的DiI RNA结合蛋白的抗体免疫组织化学。 在解剖显微镜下，用直至角膜分离容易制作切口沿着整个角膜缘移除眼睛的前部。取下角膜和晶状体。通过使沿锯齿缘和视神经削减仔细分离从眼睛的视网膜上。 通过对视神经清楚地界定这四个象限的视网膜对视网膜的边缘使四个小切口等距准备视网膜平山。用小刷子，轻轻地从视网膜删除任何剩余的玻璃体。尽可能去除尽可能多的玻璃体是获得清洁力强的免疫组织化学信号的关键。 仔细视网膜传送到含有0.5％的Triton X-100的PBS 48孔平底培养板中，以使视网膜是自由浮动。确保神经节细胞层朝上。 放置在-70℃下将培养板15分钟。在PBS中洗涤解冻视网膜，进一步通透两次在新鲜的2％的Triton X-100之后。 稀释Brn3a抗体0.3 – 0.5微克/毫升含2％的Triton X-100和2％正常驴血清的PBS。通过在4℃下轻轻摇动O / N孵育在Brn3a初级抗体溶液中的视网膜。视网膜应在任何时候都充分浸渍在150至200微升的溶液。 稀释的驴抗山羊IgG二级抗体为2微克/毫升含2％的Triton X-100的PBS孵育视网膜在该溶液中2小时在RT轻轻摇动。视网膜应充分浸渍于在所有时间该抗体溶液。用铝箔覆盖的其余步骤，以防止光漂白的培养板。 用刷子，视网膜仔细转移到幻灯片，使得组织位于平如POSsible。空气干燥10分钟。安装使用防褪色的安装介质。 检查在荧光显微镜下视网膜平板坐骑。如所述量化每视网膜象限三个非重叠区域Brn3a阳性RGC的数目。18 6.研资局轴突的量化对视神经横断面收集来自步骤4.5视神经和在2％四氧化锇2小时孵育（OSO 4，MW254.23克/摩尔）。 注意：由于其高毒性，四氧化锇应与合适的实验室装在通风橱处理。 通过在每个15分钟增加的乙醇浓度（50％，70％，90％，95％和100％），浸渍脱水视神经。 使用下列配方制备的环氧树脂：15.72毫升嵌入-812，6.45毫升十二碳烯基琥珀酸酐，7.83毫升纳迪克甲基酸酐，0.45毫升DMP-30。 依次在孵化解决方案组成的视神经0：1，1：1，0.75：0.25和1：环氧树脂的下列比率环氧丙烷（分子量58.08克/摩尔）的0。视神经在RT每个解决方案为O / N期培养。 孵育嵌入在60℃下100％环氧树脂（从6.4最后步骤）另外48小时视神经。 使用切片机生成半薄视神经截面（0.75微米）。 染色用1％甲苯胺蓝视神经横截面。 量化RGC轴突在每个视神经节描述19五个非重叠区域。