Summary
이 문서는 GPCR 이종 형성을 요구하는 행동 분석을 테스트 할 마우스 정면 피질로 바이러스 벡터를 주입하는 방법을 설명합니다.
Introduction
이러한 LSD, 실로시 빈과 메스와 같은 환각제는 인간의 의식,인지와 감정 7-9에 상당한 변화를 일으킬. 유전 또는 약리학 중 접근 방식에 의해 세로토닌 5-HT 2A 수용체 신호의 불 활성화는 크게 두 설치류 모델 3,10에서 환각제에 대한 행동 반응을 감쇠 11을 인간 원인. 환각제 다른 수용체 아형 8 바인딩 있지만, 5-HT의 2A 수용체는 이러한 화학 물질의 고유 한 행동 활동에 필요로 간주됩니다.
그룹 II 대사성 글루타메이트 수용체 (예., mGlu2 및 mGlu3)는 환각제의 분자 메커니즘과 정신병 (12)의 기초가 자신의 필수적인 역할에 대해 상당한 관심의 대상이되고있다. 이전에는 mGlu2 단백질 (mGlu2-KO 마우스)없이 식을 마우스 복도의 셀룰러 및 행동 효과에 영향을받지 것으로 입증되었다lucinogens 5. 또한, 5-HT (2a)와 mGlu2 수용체와 세로토닌 글루타메이트 리간드 1,2- 살아있는 세포에서 G 단백질 커플 링 패턴을 변조되는 특정 이종 복합체를 형성하는 것이 제안되었다.
구조적으로, 횡단 (TM) 영역 (4) 및 mGlu2 5는 5-HT의 2A 수용체 (5)과 이종 체 형성에 중요한 역할을한다. 또한, 추가 조사는 mGlu2의 TM4의 세포 내 끝에있는 세 가지 잔류 물이 세포 6 살아있는에서 5-HT (2A)의 -mGlu2 수용체 헤테로을 형성 할 필요가 있음을 보여 주었다.
이종 발현 시스템에서 관찰 이러한 연구 결과를 바탕으로, 우리가 있는지 여부를 테스트하기 위해 야생 형 mGlu2 및 mGlu2-KO 마우스의 전두엽 피질에서 mGlu2 / mGlu3 키메라 구조의 HSV-매개 표현의 사용을 설명하는 5-HT (2A) 사이의 이종 형성 및 mGlu2가 필요하다환각 5-HT 2A 수용체 작용제에 의해 유도 머리 트 행동.
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Protocol
참고 : 동물 사육과 염려에 관한 모든 절차는 마운트 시나이 의과 아이칸 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 규정에 따라 실시 하였다. 절차를 통해 멸균 장갑을 사용하십시오.
1. 약물 및 바이러스 준비
- 의약품 제조
- 12.9 ml의 % 0.9의 식염수 용액에 100 ㎎ / ㎖ 케타민 1.35 ㎖의 20 ㎎ / ㎖ 자일 라진 0.75 ml에 용해하여 15.0 ml의 케타민 / 자일 라진의 마취제를 준비합니다. 철저하게 솔루션을 섞는다.
- 바이러스 준비
- mGlu2를 복제하고 mGlu2ΔTM4N는 표준 프로토콜 이전 6 설명 따르는 bicistronic 단순 포진 바이러스 (HSV) 벡터로 구성한다. 이전 6,13,14 설명 된대로 바이러스 입자를 패키지로 제공된다. 잔류 교체 알라-677 4.40, mGlu2에서의 Ala-681 4.44 및 Ala685 4.48 Ser686 4.40, 박사에 대한e690 4.44와의 Gly-694 4.48 mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) 이전에 6 설명 하였다.
주 : 이전에 키메라 구조 HA-mGlu2ΔTM4N 그대로 G 단백질에 의존 6 신호와 함께 세포막에서 발현되는 것을 증명했다. - 에 바이러스 벡터를 저장 -80 ° C ~ 사용하지 않을 때입니다. 다음 해동 바이러스 얼음 벡터, 및 10 ㎕의 분취 량으로 나누어지는. 수술 절차는 얼음에 보관하십시오.
- mGlu2를 복제하고 mGlu2ΔTM4N는 표준 프로토콜 이전 6 설명 따르는 bicistronic 단순 포진 바이러스 (HSV) 벡터로 구성한다. 이전 6,13,14 설명 된대로 바이러스 입자를 패키지로 제공된다. 잔류 교체 알라-677 4.40, mGlu2에서의 Ala-681 4.44 및 Ala685 4.48 Ser686 4.40, 박사에 대한e690 4.44와의 Gly-694 4.48 mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) 이전에 6 설명 하였다.
2. 수술
- 수술 준비
- (1.1.1 참조 자세한 내용은) 마우스를 달아 케타민 / 자일 라진 칵테일의 적절한 투여 량으로 마우스를 주입.
- 제대로 마취 경우, 참조 응답을 유도 할 수 없습니다, 마우스가 제대로 마취 경우, 통증 응답을 발과 꼬리를 짜내 마우스를 선택합니다.
- 가위를 사용하여 코의 선단에 두개골의베이스에서 마우스 면도 헤드. 마우스 AF에 안과 젤을 적용마우스의 실명을 방지하기 위해 terward.
- 정위 프레임에 각 주사기를로드합니다. 그들은 10도 떨어져 정상에서되도록 다음 정위 프레임의 각 암의 수직 부분을 기울이십시오. 바늘이 서로 마주되도록, 팔이 기울어되어 있는지 확인합니다.
- 70 % 에탄올로 바늘을 작성하여 각 주사기를 청소합니다. 주사기가 깨끗한 지 확인하기 위해 바늘을 적어도 세 번 입력합니다.
- 바늘이 세정 된 후, 이중 증류수 H 2 O로 바늘을 작성하여 바늘 플러시 일단 플러시, 두 번 증류수 H 2 O의 1.3 μl를 각 바늘을 채우기 두 번 증류 H 2 O의 0.3 μl를 해제하기 위해 주사기의 플런저를 트위스트 바늘의 끝에서 물이 구슬은 신중하게 물을 닦아합니다. 아무것도 주사기에서 제공하지 않는 경우, 완전히 플런저를 눌러 다음 주사기의 청소를 반복합니다.
- 물을 충전 한 후, 다음 주사기를 충전 주사기를 올려공기의 0.5 μL.
- 공기와 물이 주사기되면 신중 바이러스 용액 1.3 μL로 주사기를 채우기. 이때 주사기 전량 2.8 μL인지 확인. 다시 바이러스의 0.3 μl를 해제 주사기의 끝을 비틀어. 바늘의 끝에서 액체 구슬, 조심스럽게 액체를 닦아합니다. 아무것도 주사기에서 제공하지 않는 경우, 완전히 플런저를 눌러 다음 주사기의 청소를 반복합니다.
- 외과
- 두개골 레벨과 평면이되도록 정위 프레임을 조정해야합니다 만드는 정위 프레임에 마우스를 연결합니다. 노출 된 두피에 povodine 요오드 적용합니다. 메스를 사용하여 노광 면도 지역 두개골의 정중선을 따라 시상 절개를 만든다. 그리고 두개골이 노출 남아 있는지 확인하기 위해 절개 부위에 피부에 뷰렛 클램프를 연결합니다.
- 의 봉합을 노출 골막을 멀리 용해 H 2 O 2를 사용하여두개골. 지금 브레 그마 및 봉합이 볼 수 있도록, 두개골 레벨이 있는지 확인하기 위해 정위 프레임을 조정해야합니다.
- 브레 그마와 주사기의 바늘 끝을 맞추고 브레 그마의 좌표를 기록합니다. 바늘이 삽입 될 예정의 좌표를 계산합니다.
- 주동이-Cauldal (RC)면의 경우, 기록 RC의 브레 그마 좌표 (브레 그마로부터 1.6)에 1.6 mm를 추가합니다. 지느러미 - 복부 (DV)면의 경우, 기록 DV의 브레 그마 좌표 (브레 그마에서 -2.4)에서 2.4 mm를 뺍니다.
- 마지막으로, 내측 측면 (ML)면에 대해 기록 된 ML의 브레 그마 좌표 (브레 그마로부터 2.6)에 2.6 mm를 추가합니다. 이것은 양자 주입입니다 모든 좌표를 들어, 모두 왼쪽과 오른쪽 좌표를 기록해야합니다.
- 원하는 좌표에 바늘을 가져옵니다. 바늘이 삽입되어 드릴, 표시된 영역을 드릴 될 것 곳의 장소를 표시합니다.
- 코튼 팁 어플리케이터 위스콘신과초과 혈액이나 뼈 조각을 멀리 퍼가기.
- 바늘의 끝은 뇌의 표면을 터치하는 두개골에 바늘을 가져옵니다. 그런 다음 천천히 저하 원하는 좌표에 바늘을 낮 춥니 다.
- 바늘 원하는 좌표되면 천천히 (총 0.5 μL)에 5 분에 걸쳐 분당 바늘 0.1 μL의 플런저 꼬아 주사기의 내용물을 주입.
- 주입이 완료되면 또 다른 5 분 동안 피질 주사기를 떠난다.
- 최대 닫기 / 관리
- 꾸준히 천천히 마우스 피질에서 바늘을 제거합니다. 그런 다음 정위 프레임에서 마우스를 제거합니다.
- 집게는 피부의 플랩을 잡고 함께 배치와 다음 절개 부위에서 피부의 기본 플랩에 시아 노 아크릴 레이트 (피부 접착제)를 적용합니다.
- 시아 노 아크릴 레이트가 건조하도록 허용합니다. 가열 패드가 surg 경우 선택 사항입니다 (가열 패드에 케이지에서 마우스를 놓습니다iCal의 스위트 룸은 37 ° C의 RT에서 유지 - 그렇지 않으면 필요가 없습니다). 침구는 수술 부위에 부착하지 않도록하기 위해 종이 타월에 마우스를 배치해야합니다.
- 수술 후 60 분 - 수술의 길이에 따라 마우스 (30) 내 마취 상태임을 보장한다. 수술 후, 동물은 자신의 새장에 배치하고 복구 할 수있는 그 방에 반환하기 전에 의식이 될 때까지 모니터링된다. 이들은 뇌 생화학 적 경로의 일부를 변경하여 실험 한 결과를 변경할 수 없기 때문에 진통제, 수술 후 사용되지 않는다. 그러나 그들은 수술 당일 마취에서 회복 될 때까지 동물을 모니터링하고, 감염과 통증 / 고통의 평가의 징후 일 후 작업.
3. 머리 트 위치 응답 실험
- 설정
- 삼일 stereota 후 - 2 오전 10시 2:00 PM, 사이의 모든 행동 시험을 수행바이러스 입자의 CTIC 주입입니다.
- 디졸브 (±) -1- (2,5- 디메 톡시 -4- 요오도 페닐) 2.0 ㎎ / ㎏에 0.9 % 생리 식염수로 -2- 아미노 프로판 염산염 (DOI). 또한 0.9 % 식염수 용액을 제조 하였다.
- 어떤 침구 않고 홈 케이지 (28 X 18 X 15cm)를 준비하여 비디오 카메라의 뷰 바로 위에 홈 케이지되도록 트라이 포드를 사용하여 카메라를 조정한다.
- 실험을 시작하기 전에 적어도 4 시간 동안 방에 생쥐 길들.
- 헤드 트를 기록하는 캠코더를 설정합니다.
- 실험
- 이 홈 케이지 바로 위에 오도록 카메라를 배치합니다. 전체 홈 케이지 시야에 있도록 카메라 보정.
- 마우스를 달아 0.9 % 식염수 또는 DOI 하나의 적절한 투여 량 (0.01 ㎖ / g)를 복강 마우스를 주입. 주 : 마우스 25g 무게 경우 0.25 ml의 총 부피로 투여 량을 투여.
- FO 자신의 홈 케이지 다시 각 마우스를 놓습니다R 10 분. 빈 홈 케이지의 중심으로 10 분, 대신 마우스 후 카메라의 시야 내에 맹점이 없는지 확인. 캠코더를 눌러 기록. 방을 둡니다.
참고 : 마우스 움직임과 그 안에 다양한 행동 반응 (... 머리 트, 귀 스크래치 등이 DOI에 의해 유도 된 행동 반응의 전체 목록의 곤잘레스 - Maeso 등 2,007 보충 데이터 표 1을 참조하십시오) 3, 기록한다 30 분. 따라서, 기록 시야에는 사각이없는 것이 중요하다. - 30 분은 원래의 홈 케이지에 다시 캠코더 및 장소 마우스 녹화를 중지 한 후. 각 마우스에 대해이 과정을 반복합니다.
- 리뷰
- 테이프 마우스의 실험 조건에 장님 각 심판 검토가) (예., 머리 동안 사용 된 약물은 실험 또는 두개 내 주입시 사용되는 바이러스를 트). 수동으로 모든 머리를 통해 서 트 기록심 비디오.
참고 : 머리 트가 마우스 (부가 영상)에 의해 수행 빠른 흔들림의 머리의 움직임으로 정의된다. - 각 마우스의 경우, 블라인드 심판의 세 합계에서 최종 HTR 응답을 평균. 그런 그룹이 실험 조건에 의한 값 및 통계 분석 (예., t-테스트 또는 ANOVA)을 실시합니다.
- 테이프 마우스의 실험 조건에 장님 각 심판 검토가) (예., 머리 동안 사용 된 약물은 실험 또는 두개 내 주입시 사용되는 바이러스를 트). 수동으로 모든 머리를 통해 서 트 기록심 비디오.
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Representative Results
이전의 결과는 환각제 의해 확실하고 견고하게 유도되는 쥐의 행동 반응을 헤드 트 위치 함을 입증하고, 5-HT 2A -KO 마우스 3 부재. 또한, DOI 및 LSD 환각 5-HT 2A의 작용제에 의해 유발 헤드 트 반응이 크게 mGlu2-KO 마우스 5 감소되었음을 보였다. 그러나, 비록 이전의 연구 결과는 설득력 미해결 남아 살아있는 생쥐의 등이 구조적 배열의 동작 여부를 5-HT 2a 및 mGlu2가, 형질 감염된 세포 1,2,15 시험 관내에서 이종 복합체로 조립되어 있음을 보여줍니다. 완전히 본 manip 여부를 검사 mGlu2-KO 마우스의 전두엽 피질 mGlu2 또는 mGlu2ΔTM4N 하나의 환각 5-HT 2A 수용체 작용제, 식에 의해 유도 된 정신 같은 효과, 5-HT 2A의 -mGlu2 수용체 헤테로의 역할을 이해위험률 행동을 조절한다.
마우스는 혼자 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 mGlu2 또는 mGlu2ΔTM4N하거나, GFP를 표현 bicistronic HSV의 내 전두엽 피질 주사를 받았다. 첫째, 바이러스 마우스 전두엽 피질 또는 mGlu2 mGlu2ΔTM4N (도 1a 및도 1b)을 통해이 - 발현을 확인 하였다. 이전 5 입증 된 바와 같이, DOI에 의해 유도 머리 트의 동작은 빈 벡터 HSV-GFP를 주사 mGlu2-KO 마우스에 존재했다. 특히, 환각 5-HT의 2A 작용제 DOI에 의해 유도 된 머리 트 위치 응답을 통해 발현 mGlu2을 mGlu2-KO 생쥐에서 구출했지만, mGlu2ΔTM4N, 전두엽 피질에서 GFP (그림 1C)을 발현하는 동물에서 볼 수에 비해하지. 함께,이 결과는 전두엽 피질에서 5-HT 2A의 -mGlu2 수용체 복합체 정신병과 같은 상태를 조절하기위한 중요한 것을 시사한다.
5-HT의 2A와 수용체로 mGlu2의 수용체 헤테로. 식으로 mGlu2 1. 식 그림은 환각 약물에 의해 유도 된 정신병과 같은 행동이 필요하다. (A) 정면 피질에서 HSV-매개 유전자 발현의 대표 이미지입니다. 또한 GFP를 표현 HSV-mGlu2는, 정면 피질에 주입하고, GFP의 발현을 면역 세포 화학, 스케일 바, 200 음에 의해 밝혀졌다. (B) mGlu2-KO 마우스의 마우스 전두엽 피질에서 유전자 발현을 매개 HSV 및 항 - mGlu2 반응성 웨스턴 블롯으로 측정 하였다. mGlu2 수용체에 대한 일차 항체의 특이성는 이전에 녹아웃 생쥐 6 확인되었다. 대사성 글루타메이트 수용체는 공유 결합 된 GPCR 동종이 량체를 형성한다. 우리는 단량체 (100 kDa의) 6으로 mGlu2의 면역 반응을 측정 하였다. (C 등 (2012)에서 수정 된 대표 6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1. 머리 트 위치 응답. (오른쪽 다운로드 클릭). CD-1 WT 마우스가 2.0 ㎎ / ㎏ DOI 주사와 케이지에 넣고 머리 트 반응을 유도하기 위해 (벽 두 케이지 사이에 블랙 아웃) (동작 후 도출 *).
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Discussion
함께 mGlu2-KO 마우스 (5) 이전의 결과와 함께 배양 된 세포에서의 5-HT 2A의 -mGlu2 수용체 복합체를 형성하지 않는 mGlu2 및 mGlu2 / mGlu3 키메라 구조와 결과가 제안하는 5-HT의 2A -mGlu2에서 이종 체 수용체 복합체 마우스 전두엽 피질 LSD 같은 환각 5-HT 2A 수용체 작용제에 의해 헤드 트 동작을 유도하는데 필요하다. 이 방법의 한계는 기본 조직의 세포 내 수준에 가까운 분자 근접을 측정하지 않습니다. 또한, 주목해야 다양한 한계점이있다. 주 사후 4 일 - 생쥐는 HSV 바이러스 벡터를 주입하기 때문에, 실험이 수행 될 수있는 시간 프레임 (2)이다. 바이러스 벡터의 위치와 표현은 더 이상 4 일 이내 초기 주입 후 단면 한 뇌의 면역 형광 염색 확인해야합니다. 마우스되는 좌표가 일치하지 않거나 바이러스 벡터를 표현한다하지그들은 mGlu2 또는 mGlu2ΔTM4N을 표현하지 않는 실험 데이터에서 제외 될 수있다. 정위 수술도 중요 후 머리 상처의 부적절한 폐쇄가 생체 내 실험 및 면역 형광 염색 모두에서 문제가 발생할 수 있습니다 감염으로 이어질 수, 케어. 바이러스 입자의 주입 후 4 - 마지막으로, 정위 주사 어떤 행동 패러다임 (. 오픈 필드 교류 t 검정 등) 이후로는,이 조건으로 사용될 수있다. 또, 좌표와 표현은 면역에 의해 확인되어야한다.
호모 및 / 또는 살아있는 세포에서 heteromers로 된 GPCR의 기능은 지금 잘 16-18를 설립 개념입니다. 그러나 일부 진보에도 불구하고, 더 많은 연구가 전체 동물 모델 19 GPCR의 이종 복합체의 정확한 역할 (들)을 정의하는 데 필요하다. 이러한 브렛 및 / 또는 FRET 영상과 같은 접근 방법은 작은 동물의 깊은 조직 내에서 단백질 - 단백질 물리적 근접성을 조사하기모델 피험자 20 거주 GPCR의 heteromers의 기능적 역할에 대한 이해를 향상시키는 수단을 제공 할 수있다. 천연 또는 변형 된 횡단 단백질의 GPCR 중의 HSV - 매개 발현을 이용하여,의 GPCR의 기능과 상호 작용을 평가하는 생체 내 모델을 제공한다.
설치류 모델에서 더 연구는 21-23, 구조 재 배열 구성 요소 (24), 및 수용체 내재화 25, 26 후 잠재적 인 G 단백질 결합 사이 GPCR의 heteromers의 안정성과 생명 시간 (형성과 분리를) 검토 할 필요가있다. 세포 신호 및 기능에서의 GPCR의 근본적인 역할을 감안할 때, 그것은이 지역이 흥미 기본 및 번역 연구로 이어질 수있는 것으로 보인다.
추가 조사는 정량적으로 이전 스투와 함께, 인간 및 마우스 CNS의 두 수용체의 미세 공동 지방화를 특성화하기 위해 필요하지만설득력 여기서 설명 HSV 매개 표현 방식을 사용하여 얻어진 결과는 제언 전기 생리 셀룰러 입증 및 마우스 모델에서 환각제에 의해 유도 된 행동 반응은 5-HT의 2A 수용체 발현 피질 피라미드 신경 3,27,28 본질적인 것으로 사망 마우스 전두엽 피질에서 5-HT 2a 및 mGlu2 수용체 간의 이종 형성은 환각 5-HT 2A 수용체 작용제에 의해 유도 된 DOI 헤드 경련 정신병과 같은 행동이 필요하다.
mGlu2의 발현을 HSV 매개 아니지만 mGlu2ΔTM4N은 mGlu2-KO 마우스의 전두엽 피질 뉴런에 환각 5-HT 2A 수용체 작용제에 의해 유도 된 DOI 헤드 트 동작을 구출. 전임상 연구는 GPCR의 heteromers의 행동 표현형을 평가하기 위해이 번역 도구가 유용 할 수 있습니다.
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Acknowledgments
NIH R01MH084894이 연구의 자금 조달에 참여했다. 우리는 박사에게 감사의 말씀을 전합니다. 마우스의 기부금이 작품의 촬영 기간 동안 자신의 수술과 행동 시설의 사용에 대한 의학의 마운트 시나이 학교에서 야스민 허드와 스콧 루소.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mGlu2 bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| mGlu2ΔTM4N bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| GFP bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| Xylazine | Lloyd | List no. 4811-20ml, NADA #139-236, NDC Code(s): 61311-481-10 | 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution |
| Ketamine | Vedco | KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC Code(s): 50989-161-06 | 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution |
| Ophthalmic gel | Fisher Scientific | NC0550805 | |
| Burret clips | Fisher Scientific | NC9268369 | |
| Feather surgical blade | Fisher Scientific | NC9032736 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 19-898-919 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14815203 | |
| Hamilton™ Small Hub Removable Needles (33 Ga) | Fisher Scientific | 14816206 | |
| Cordless Micro Drill | Fisher Scientific | NC9089241 | |
| Dermabond Dermal Adhesive | Fisher Scientific | NC0690470 | |
| (±)-1-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane hydrochloride (DOI) | Sigma-Aldrich | 42203-78-1 | Dissolved in 0.9% saline solution to the concentration of 2.0 mg/kg |
References
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