In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

De fundamentele patronen en functie van activiteit in de hersenen en de discrete structuren lang een gebied van intensief onderzoek op het gebied van neurologie. Misschien enkele vroegste succesvolle benaderingen voor dit probleem waren direct fysiologische meting van de verandering in de elektrische activiteit – maar alternatieve methoden die levende beeldvorming van veranderingen in spanning, pH of calciumconcentraties (als indicatie voor activiteit) laten hebben extra mogelijkheden voor gebracht de studie van neuronale activiteit ^1. Beeldvormingstechnieken voeren een breed scala van voordelen zoals verminderde invasiviteit en de mogelijkheid om te controleren activiteit in gehele hersenstructuren. Verder bij dieren met handelbare genetica, waaronder de fruitvlieg Drosophila, de ontwikkeling van genetisch gecodeerd calcium indicatoren, zoals cameleon, GCaMPs en anderen ¹ hebben toegestaan ​​onderzoekers enkele neuronen, neuronale populaties en hele hersenen te controlerenstructuren. Terwijl meer traditionele TL calcium beeldvormende methoden gebruiken GCaMPs (GFP gefuseerd met calmoduline) of FRET (GVB en YFP gefuseerd met calmoduline) hebben bewezen nuttige technieken verstrekken van goede ruimtelijke en temporele resolutie te zijn, het onderliggende proces van licht excitatie wekt een aantal beperkingen op de experimentele toepassingen. Vanwege de aard van het excitatie licht, autofluorescentie, foto-bleken en fototoxiciteit onvermijdelijk worden geproduceerd die dientengevolge beperkt de diepte van de structuren die kunnen worden afgebeeld, de duur van de opnames en de continuïteit van real time opname. Met andere woorden, opnamen moeten vaak intermitterend uitgevoerd om de ongewenste bijwerkingen te voorkomen.

Vanwege deze problemen zijn aanvullende alternatieve calcium beeldvorming ontwikkeld. Een van de meest veelbelovende methoden bioluminescentie beeldvorming, die berust op licht geproduceerd door een enzymatische reactie na calcium binding. Bioluminescent beeldvorming niet licht excitatie vereisen en dus niet dezelfde problemen als conventionele calcium imaging ervaren. Het bioluminescente reporter aequorine – geïsoleerd uit Aequorea victoria, dezelfde kwal waaruit GFP werd isolated- bindt calcium via de drie EF kant structuren en ondergaat een vormverandering, die leidt tot de oxidatie van de coelenterazine cofactor en de vrijlating van blauw licht (λ = 469 nm) ^2,3. Aequorine heeft een lage affiniteit voor calcium _(Kd = 10 uM) dat ideaal toezicht calcium transiënten omdat het zeer weinig ruis en niet interfereert met het intracellulaire calcium buffersysteem ⁴ maakt. Hoewel aequorine eerder is gebruikt om het proces van neurale inductie monitoren de Xenopus ei ⁵ het geproduceerde licht is te zwak om te gebruiken voor real time imaging van neuronale activiteit. In een poging om deze uitdaging, Philippe Br & pakken# 251; laat en collega's bij het ​​Instituut Pasteur creëerde een genetisch construct fuseren GFP en aequorine genen, het nabootsen van de inheemse staat binnen de kwallen ^4. Dit fusiegen product bindt calcium weer via de drie EF kant structuren van aequorine, waarbij een conformationele verandering die leidt tot oxidatie van coelenterazine, welke energie niet radiatief overdraagt ​​aan de GFP ondergaat. Deze energieoverdracht resulteert in het vrijkomen van groen licht (λ = 509 nm) van GFP, in plaats van blauw licht van aequorine. De fusie van GFP en aequorine verleent ook een grotere eiwitstabiliteit helpen het fusie-eiwit te produceren licht 19-65 keer helderder dan alleen ⁴ aequorine. Met een bioluminescente benadering in de hersenen breidt de huidige experiment met calcium beeldvorming zowel wat de duur van continue registratie en het aantal structuren binnen de hersenen die kan worden opgenomen. In grote lijnen in de context van eerder werk betekent dat zowel globale en meerverscheidenheid van geregionaliseerde "activiteit" van de hersenen kan worden bewaakt (door de proxy van calcium transiënten). Belangrijker kan worden geregistreerd langer, in real time en continu, die gemakkelijk leent voor de uitoefening van een volledig begrip van basale functie in de hersenen.

In de laatste jaren hebben ons laboratorium en anderen transgene vliegen expressie brengen van het GFP-aequorine onder de controle van de binaire expressiesysteem (GAL4 / UAS-GFP-aequorine) ^5,6 ontwikkeld. We hebben gebruik GFP-aequorine bioluminescentie naar record activiteit door natuurlijke stimuli zoals geur ^7,8, en bestudeerden de cellulaire componenten modulerende ^Ca2 + -activity de mushroom bodies volgende acetylcholine receptor stimulering door directe nicotinezuur toepassing ^9. Daarnaast hebben we ook GFP-aequorine een aantal experimentele vragen die niet in staat zijn eerder gericht, zoals langdurige pakkenbeeldvorming van spontane calcium transiënten en visualisatie van diepere hersenstructuren ^10. Recenter hebben we de GAL4 / UAS systeem om de zoogdierlijke ATP receptor P2X ₂ ¹¹ een kation kanaal in de projectie neuronen (PN) expressie en gebruikt het LexA systeem GFP-aequorine in de champignon organen expressie (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (een hoffelijkheid van B. Pfeiffer, Janelia Boerderij, Verenigde Staten). Daardoor hebben we de PN activeren toepassing van ATP, dat op zijn beurt activeert de champignon organen (een stroomafwaarts doel van de PN), nabootsen meer natuurlijke omstandigheden, zoals de respons op een stimulus geur. Overall deze techniek combineren P2X _{2 en} GFP-aequorine breidt de experimentele mogelijkheden. In grote lijnen biedt de mogelijkheid om de activiteitspatronen beter inzicht in de hersenen, het initiëren van nieuwe studies over verschillende stimuli en perturbaties de basale patronen van activiteit kan veranderen.