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Inmunología y contagio

Sviluppo e validazione di un metodo quantitativo per PCR Equid herpesvirus-2 Diagnostica in respiratorie Fluidi

Published: March 17, 2016
doi:
10.3791/53672
, , , , , ,
1LABÉO Frank Duncombe, 2Unité de Risques Microbiens (U2RM, EA 4655),Normandy University, 3Hippolia Foundation

Summary

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

Abstract

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis.

Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories.

This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Introduction

Equid herpesvirus-2 (EHV-2) è coinvolto in una sindrome respiratoria, con potenziali manifestazioni cliniche quali la secrezione nasale, faringite e gonfiore dei linfonodi 1-3. Questo virus è anche sospettato di essere associati con i poveri prestazioni di cavalli, che può provocare un impatto economico significativo e negativo per l'industria del cavallo 2.

Fino ad ora, il gold standard per gamma-EHV (γ-EHV) di rilevamento è stato il metodo di coltura delle cellule. Il primo inconveniente di questo procedimento era l'assenza di discriminazione tra EHV-2 e altri γ-EHV di (ad esempio, EHV-5). Il secondo inconveniente è stato il lento sviluppo del processo citopatico, che dura da 12 a 28 giorni per manifestare 4,5.

Sviluppo di un real-time polymerase chain reaction quantitativa convalidato e normalizzati (qRT-PCR) metodo contribuirà a individuare rapidamente il virus, di discriminare tra EHV-2 e EHV-5 e studiare il rapporto tra il carico genoma virale e la malattia grazie all'aspetto quantificazione.

Reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata descritta per la prima volta nel 1986 da Mullis 6 e sta per diventare il nuovo standard nella maggior parte dei settori di diagnosi biologica (umana, ambiente e veterinaria). Questo metodo, che si basa sull'amplificazione di una parte del genoma di agenti patogeni, presenta molti vantaggi: specificità, sensibilità e rapidità. Inoltre, il rischio di contaminazione ampliconi si ritirò dopo l'avvento di qRT-PCR e la garanzia della qualità 7. Tuttavia, il riconoscimento di PCR come nuovo metodo gold standard richiedeva più appena migliorata dati prestazioni, ma anche la dimostrazione del controllo di sviluppo e validazione fasi dell'intero metodo senza degrado delle prestazioni nel tempo.

I primi strumenti molecolari utilizzati per il rilevamento di EHV-2 erano tempo cl'amplificazione non specifica onsuming e coinvolto con nested PCR seguita da sequenziamento 8. I geni mirati per herpes virus sono stati acido desossiribonucleico (DNA) polimerasi e DNA confezionamento 9. Tuttavia, nested PCR presenta un elevato rischio di contaminazione da ampliconi. Da allora, i test di PCR convenzionali sono stati progettati per amplificare l'interleuchina gene 10-like o gene B glicoproteina, rivisto nel 2009 2. Più di recente, le caratteristiche di PCR in tempo reale sono stati descritti per la quantificazione del EHV-2 10, ma non erano disponibili dati riguardanti la convalida dell'intero metodo comprendendo il processo di estrazione.

In questo protocollo, procedure di sviluppo e di validazione sono descritti per un metodo quantitativo PCR per il rilevamento e la quantificazione di EHV-2 DNA nei fluidi respiratori equini secondo l'Association française de la normalizzazione (AFNOR) norma NF U47-600 3,11,12, che è il rappresentante franceseil comitato di normalizzazione internazionale. Dettagli Questa norma i "Requisiti e raccomandazioni per l'implementazione, lo sviluppo e la validazione di PCR veterinaria metodo di analisi della salute degli animali" 11,12, secondo la NF EN ISO / CEI 17025, 2005 13 e OIE (Organizzazione Mondiale per la Salute Animale) . raccomandazioni, 2010 14 il protocollo di validazione qRT-PCR EHV-2 comporta una procedura in tre parti: (a) lo sviluppo del saggio qRT-PCR, (b) caratterizzazione dei test qRT-PCR da solo e (c) la caratterizzazione di tutta la metodo analitico (dall'estrazione degli acidi nucleici dal campione biologico ad analisi PCR).

La caratterizzazione del dosaggio qRT-PCR e dell'intero metodo analitico comprende la definizione di due limiti: il limite di rilevazione (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ). Il LOD 95% PCR rappresenta il più basso numero di copie di acidi nucleici per unità di volume che possono essere rilevati nel 95% di tutti i cases. Il LOQ 95% PCR rappresenta la quantità più bassa di copie di acidi nucleici che può essere determinato tenendo conto delle incertezze.

Questo metodo qRT-PCR permette la rilevazione precisa e rapida quantificazione di EHV-2 nei fluidi respiratori. Inoltre, il metodo può essere applicato in altri laboratori per garantire una procedura standardizzata e modello come generale per lo sviluppo di altri nuovi saggi qRT-PCR.

Protocol

Nota: fare riferimento a tutte le varie fasi, che sono illustrati nella Figura 1. 1. Estrazione di acidi nucleici Nota: Eseguire l'estrazione sotto una cappa aspirante per limitare la contaminazione delle vie aeree con acidi nucleici. Includere un controllo negativo estrazione con acqua trattata con DEPC per garantire che nessuno dei reagenti sono contaminati con DNA indesiderato. Estratto acidi nucleici dal campione biologico secondo un protocollo protocollo 15 e produttore precedentemente descritto. Aggiungere 140 pl di campione biologico a 560 ml di soluzione di lisi (tampone AVL) e incubare per 10 min a temperatura ambiente. Aggiungere 560 ml di etanolo. Applicare i primi 630 ml di questa soluzione (campione + lisi soluzione + etanolo) ad una colonna di silice e centrifugare. Applicare i restanti 630 ml di questa soluzione alla stessa colonna di silice e centrifugare. Quindi lavare la colonna con 500 microlitridi 2 diversi tamponi di lavaggio (AW1 e Aw2). Eluire acido nucleico con 50 ml di tampone di eluizione (tampone AVE) ed equilibrare a temperatura ambiente. Chiudere il coperchio e incubare a temperatura ambiente per 1 min. Centrifugare a 6,000 g per 1 min. 2. Procedura di amplificazione Preparare 22,5 ml di mix di reazione per ogni reazione. Aggiungere 12,5 ml di PCR Master Mix, x ml di 20 micron di primer in avanti, x ml di 20 micron di primer inverso, y ml di sonda 10 micron e z ml di acqua ultrapura come richiesto per raggiungere 22,5 ml (x, i volumi Y e Z sono ottenuti dopo la titolazione, vedere le sezioni 3.2.3 e 3.2.6). Aliquotare 22,5 ml di miscela di reazione appropriata a ciascun pozzetto di reazione in una piastra da 96 pozzetti. Nota: includere controlli negativi per l'estrazione e per PCR per garantire che nessuno dei reagenti sono contaminati con DNA indesiderato. Aggiungere 2,5 ml di campione, 2,5 ml di estrazione negativcontrollo e, 2,5 ml di PCR controllo negativo e 2,5 ml di campione positivo (ceppo di riferimento o plasmide) al corrispondente pozzetto di reazione. Dopo la distribuzione, coprire la piastra con un sigillo piastra adesiva. Centrifugare la piastra per 10 secondi a 6.000 g. Porre la piastra in un sistema PCR Real-Time. Selezionare il modello per il layout del test e iniziare la corsa. Utilizzare l'impostazione del programma PCR: 10 min a 95 ° C seguiti da 45 cicli di 15 secondi a 95 ° C e 1 min a 60 ° C (Tabella 1). Trasferire i dati grezzi dal sistema PCR Real-Time di un foglio di calcolo. Impostare la soglia per i grafici di amplificazione sopra la linea di base e all'interno della regione di crescita esponenziale avere la ciclo soglia per ogni campione. Tracciare ogni standard set point come una curva standard per ottenere la linearità. Calcolare il numero di copie per i diversi campioni sulla base della curva standard. 3. Sviluppo di RT-PCR quantitativa Nota: Lo sviluppo di un test qRT-PCR richiede ceppi di riferimento, una specifica plasmide titolata, e diversi controlli e comporta la titolazione dei primer e della sonda. prova preliminare Primer design e sonde con software specifico in base alle raccomandazioni precedenti 16. Estrarre ceppi di riferimento come descritto nella sezione 1. Amplificare come descritto nella sezione 2 con 900 nM per la concentrazione finale di primer e 250 nM per la concentrazione finale di sonda. Analizzare il segnale come descritto nella sezione 2.5. Allo stesso tempo, eseguire amplificazione del DNA ceppi di riferimento (come descritto nella sezione 3.1.3) senza sonde. Sequenziare il ampliconi ottenuti con il metodo Sanger 17,18. Analizzare le sequenze eseguendo un BLAST nucleotide 19. Titolazione di primer e sonda Preparare 3 differenti miscele con 250 nM concentrazione finale di sonda e con diversi Conc finalezioni di avanti e indietro primer (50 Nm / 50 Nm, 300 Nm / 300 Nm, 900 Nm / 900 nm) per i 3 repliche del campione positivo e un controllo negativo. Per ogni miscela, aggiungere lo stesso volume appropriato di 20 pM forward primer e 20 pM primer reverse (0,25 ml per ottenere la concentrazione finale di 50 nM, 1,5 ml per ottenere i 300 nM concentrazione finale o 4,5 ml per ottenere la concentrazione finale di 900 nM) , 50 ml di PCR Master mix, 2,5 ml di sonda 10 micron e acqua ultrapura come richiesto per raggiungere i 90 ml. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Scegliere la migliore condizione per ottenere il massimo livello di amplificazione, soglia primo ciclo (Ct) e migliore ripetibilità tra le 3 condizioni. Determinare la migliore concentrazione ed il corrispondente volume di x ml di primer in avanti e retromarcia. Preparare 5 miscele diverse per i 4 campioni (3 repliche del campione positivo e un controllo negativo)con 5 diverse concentrazioni finali di sonda (50 nm, e 100 nm, 150 Nm, 200 Nm, 250 Nm). Per ogni miscela, aggiungere x ml di 20 micron di primer in avanti e x ml di 20 mM primer reverse (precedentemente determinato, al punto 3.2.3), 50 ml di PCR Master Mix, il volume appropriato di 10 micron sonda (0,5 ml per ottenere il 50 concentrazione nM, 1 ml per ottenere la concentrazione di 100 nM, 1,5 microlitri per ottenere la concentrazione 150 nM, 2 microlitri per ottenere la concentrazione 200 nM o 2,5 microlitri avere la 250 concentrazione nM) e acqua ultrapura come richiesto per raggiungere i 90 microlitri. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Scegliere la migliore condizione per ottenere il massimo livello di amplificazione, soglia primo ciclo (Ct) e migliore ripetibilità tra le 5 condizioni. Determinare la migliore concentrazione e il volume corrispondente y microlitri per la sonda. 4. Caratterizzazione di Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) Nota: Dopo la fase di sviluppo e la determinazione delle migliori condizioni di utilizzare, il passo caratterizzazione della PCR comprende la specificità, il limite di rilevazione, la gamma di linearità e il limite di quantificazione di qRT-PCR. Preparazione e titolazione di plasmidi Ordine plasmide commerciale contenente il relativo frammento del gene target DNA scelto per la PCR (in questo protocollo, i nucleotidi 2081-2381 di EHV-2 gene della glicoproteina B, vedi tabella 1). Nota: Per limitare il rischio di contaminazione delle vie aeree con DNA sintetico, eseguire diluizioni seriali di plasmidi sotto una cappa in una camera separata e lavorare con DNA diluito durante tutte le fasi di sviluppo e procedura di convalida. Risospendere il plasmide con acqua ultrapura per preparare una soluzione madre a 50 ng / ml. Vortex e centrifugare brevemente la soluzione plasmide magazzino. Nota: Determinare la vera concentrazione della STO plasmidesoluzione ck dopo risospensione al fine di calcolare il numero di copie del plasmide. Aggiungere 1 ml di plasmide allo spettrofotometro. Leggere la densità ottica (OD) a 230 nm, 260 nm e 280 nm. Leggere la concentrazione di DNA sul software spettrofotometro (OD, 260 nm). Calcolare il numero di copie del plasmide utilizzando il numero di Avogadro (N A) e la formula: Numero di copie / ml = (N A [plasmide in ng / ml]) / (lunghezza plasmide x 10 9 x peso medio di una coppia di basi) = (6.022 x 10 23 x [plasmide]) / (lunghezza plasmide x 10 9 x 660) Test del Specificità (inclusività ed esclusività) di qRT-PCR Testare l'inclusività del sistema PCR. Selezionare EHV-2 campioni di DNA positivi, precedentemente caratterizzata da sequenziamento (stabilito lo stato positivo). Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. analizzare ladati PCR per ciascun campione, come descritto nella sezione 2.5. Controllare la presenza di una curva esponenziale per tutti i campioni prelevati al punto 4.2.1 e confermare inclusione di PCR. Testare l'esclusività del sistema PCR utilizzando estratti di DNA da agenti patogeni con somiglianze genetiche al bersaglio (in questo caso, altri herpesvirus equide, come EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV-5 e asinino herpesvirus-5 come descritto nella tabella 2) e altri agenti patogeni coinvolti nelle malattie respiratorie dell'ospite (in questo caso, il virus arterite equina, il virus dell'influenza equina, Coxiella burnetii, Rhodococcus equi, Streptococcus equi equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Chlamydophila abortus e Klebsiella pneumoniae, vedi tabella 2). Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Analizzare i dati PCR per ogni campione come descritto nella sezione 2.5. Controllare l'assenza di una curva esponenziale per tutti i campioni sceltisezione 4.2.4 per confermare l'esclusività della PCR. Limite di Rilevazione di qRT-PCR Dispensare 90 ml di acqua ultrapura in 6 tubi. Eseguire 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide di indirizzare la zona di abbattimento (perdita di rilevazione Ct). Trasferimento 10 microlitri dal plasmide diluizione di lavoro al tubo con 90 ml di acqua ultrapura. Vortex e centrifugare brevemente la provetta. Ripetere il punto 4.3.2 fino all'ultimo tubo nella diluizione in serie ha ricevuto il plasmide. Eseguire l'amplificazione delle 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide come descritto nella sezione 2. Determinare la zona di abbattimento: la zona tra l'ultima diluizione del plasmide è presente un segnale positivo e la prima diluizione senza rilevamento (vedere la Figura 2). Per avviare i 6 diluizioni seriali di due-fold, scegliere l'ultima diluizione del plasmide che dà un segnale positivo (vedi paragrafo 4.3.4). Nota: Eseguire 3 tri indipendenteals per determinare il limite di rilevazione di qRT-PCR (LOD 95% PCR) Dispensare 25 ml di acqua ultrapura in 6 tubi. Eseguire 6 diluizioni seriali duplici del plasmide. Trasferimento 25 microlitri dalla diluizione di lavoro plasmide, determinato al punto 4.3.5, al tubo con 25 ml di acqua ultrapura. Vortex e centrifugare brevemente la provetta. Ripetere il punto 4.3.7 fino all'ultimo tubo nella diluizione in serie ha ricevuto il plasmide. Eseguire l'amplificazione delle 6 diluizioni seriali duplici del plasmide come descritto nella sezione 2. Ripetere i punti 4.3.7 a 4.3.8 per due volte, per ottenere 3 prove con 8 repliche (24 replicati) di ciascuno dei 6 dieci volte diluizioni seriali del plasmide. Nota: Il limite di rilevazione di qRT-PCR (LOD 95% PCR) è definito come il numero più basso copie di DNA per unità di volume che viene rilevato nel 95% dei casi. Calcolare il numero di repliche positive di 24 replicati per ogni livello di concentrazione plasmidezione. Determinare il LOD 95% PCR. Il LOD 95% PCR è il livello che comporta la rilevazione di 23 replicati positivi su 24 replicati. Gamma di linearità e limite di quantificazione dei qRT-PCR Nota: eseguire 4 prove indipendenti con 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide per assicurare che la concentrazione minima utilizzata nell'intervallo corrispondente al LOD 95% PCR determinato in precedenza in 4.3.10. Dispensare 45 ml di acqua ultrapura a 6 tubi. Avviare i 6 diluizioni seriali dieci volte con la concentrazione di plasmide diluizione di lavoro corrispondente a 10 7 LOD 95% PCR. Eseguire 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide. Transfer 5 microlitri dalla diluizione di lavoro plasmide (determinato al punto 4.4.2) nella provetta con 45 ml di acqua ultrapura. Vortex e centrifugare brevemente la provetta. Ripetere il punto 4.4.3 fino all'ultimo tubo nella diluizione in serie ha ricevuto plasmid. Amplificare i 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide come descritto nella sezione 2. Tracciare la regressione lineare y = ax + b con per la pendenza e b per l'intercetta (Figura 3). Calcolare l'efficienza di amplificazione (E) dalla pendenza di una curva standard (vedi 4.4.5) utilizzando l'equazione: . Ripetere i punti 4.4.1 a 4.4.6 tre volte. Nota: efficienza di amplificazione rappresenta la quantità di aumento prodotto di PCR dopo ogni ciclo. Una reazione ideale raggiunge efficienza vicino al 100%. In pratica, E (%) è tra il 75% e il 125%. Superiore E può indicare l'amplificazione di prodotti non specifici o un errore di pipettamento nella diluizione seriale. Lower E può anche indicare un errore di pipettamento nella diluizione in serie, cattiva progettazione primer o condizioni di reazione non ottimali. Calcolare il bias (Tabella3). Verificare per ogni livello plasmide che il valore di polarizzazione assoluto è inferiore al valore di polarizzazione critica (0,25 log 10). Determinare la polarizzazione media e le incertezze di linearità (U Lini) per ogni livello plasmide (Tabella 3) per valutare le prestazioni di regressione lineare per EHV-2 qPCR (Figura 4). U Lini è l'incertezza linearità determinata per ogni i plasmide livello calcolato da deviazione standard (SD'i) e media bias. Determinare l'incertezza linearità combinata (U LIN) di EHV-2 qPCR dato dalla formula: Nota: L'accettazione di bias è specificato dal laboratorio (in generale pregiudizi assoluto 0,25 log 10) e corrisponde alla differenza tra il valore più basso e il valore più alto di 0,5 log 10 (quantità misurata in log 10 numero di copie). U LIN </sub> valore potrebbe aiutare a confrontare le prestazioni di qPCR da diversi laboratori. Determinare il limite di quantificazione del qRT-PCR (LOQ PCR): LOQ PCR è la più bassa concentrazione con una polarizzazione 0,25 log 10 usato per il campo di linearità (Tabella 3). 5. Caratterizzazione del metodo analitico totale (da DNA Extraction al risultato qRT-PCR) Nota: La caratterizzazione di tutto il metodo è la convalida di tutti i passi necessari per ottenere dati qRT-PCR (vale a dire, dalla estrazione del DNA dal campione respiratoria (vedere paragrafo 1) per l'amplificazione e quantificazione del target (vedere la sezione 2 )). Stabilire corrispondenza tra il numero di copie nella reazione PCR e il numero di copie presenti nel campione biologico con la formula: . Il <img alt="5.1-2" src="/files/ftp_upload/53672/5.1-2.jpg" /> È il numero di copie del plasmide nella reazione PCR, è il volume del campione aggiunto alla miscela PCR per l'amplificazione, è il volume di tampone AVE usato per eluire gli acidi nucleici e è il volume del campione estratto. Testare la sensibilità e specificità del metodo analitico intero Nota: Solo note positive (o negative) campioni EHV-2 sono utilizzati in questa sezione. Testare la "sensibilità" del metodo qRT-PCR analizzando campioni positivi per il target (EHV-2). Selezionare EHV-2 campioni di DNA positivi, precedentemente caratterizzato (stato positivo). Estrarre l'acido nucleico come descritto nella sezione 1. Eseguire una procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Determinare il numero di positivi reali (campioni positiviche sono positive con questo RT-PCR) e il numero di falsi negativi (noto campioni positivi che sono negativi con questa RT-PCR). Testare il "specificità" del metodo qRT-PCR analizzando campioni negativi Selezionare EHV-2 campioni di DNA negativi (stato negativo). Estrarre l'acido nucleico come descritto nella sezione 1. Eseguire una procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Determinare il numero di negativi reali (campioni negativi che sono noti per essere negativa con questo RT-PCR) e il numero di falsi positivi (noti campioni negativi che sono positivi con questo RT-PCR). Calcolare il "sensibilità diagnostica" (Se) e "specificità diagnostica" (Sp) di tutto il metodo (tabella 4) come segue: Se = numero di positivi reali / (numero di veri positivi + falsi negativi) e Sp = numero di reale negativi / (numero di reale negativos + falsi positivi) (vedi tabella 4). Calcola l'intervallo di confidenza del 95% per la sensibilità e la specificità del tutto il metodo con la formula del Greiner e Gardner relazione 12,20: dove e è l'errore previsto, θ è il Se (o Sp) ed n il numero di campioni analizzati. Nota: Per un piccolo numero di campioni, utilizzare la tabella Schwartz secondo AFNOR norma 12 per calcolare l'intervallo di confidenza del 95% per la sensibilità e la specificità di tutta metodo. Preparazione di negativo risorsa materiale per la caratterizzazione del metodo analitico intero ATTENZIONE: per determinare i limiti di rilevazione e quantificazione del tutto il metodo (LOD metodo e il metodo LOQ), aggiungere concentrazioni note di plasmide per i campioni biologici che sono noti per essere liberidel target (EHV-2 in questo caso). Questi campioni, insieme con il plasmide quantificato, costituiscono norme positive con cui determinare il metodo LOD e il metodo LOQ. Confermare l'assenza di destinazione (EHV-2) nei campioni biologici utilizzati per la costruzione di norme positive. Scegliere diversi campioni biologici negativi noti. Estrarre campioni biologici come descritto nel paragrafo 1. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Confermare l'assenza di bersaglio di assenza del segnale di PCR in questi campioni. Nota: utilizzare lo stesso materiale risorsa negativa per tutti i passaggi tra 5.4 e 5.5. Pool diversi campioni negativi per ottenere 15 ml di materiale risorsa negativa (un volume necessario per la convalida completa). Dispensare 135 ml di questo materiale risorsa negativa in 100 provette. Mantenere provette a + 4 ° C oa -80 ° C per lunga conservazione. Limit di rilevazione del metodo analitico intero Determinare la zona di abbattimento dell'intero metodo. Dispensare 45 ml di acqua ultrapura a 6 tubi. Eseguire 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide. Transfer 5 microlitri dalla diluizione di lavoro plasmide corrispondente a 10 7 LOD 95% PCR (come determinato al punto 4.3.10) al tubo con 45 ml di acqua ultrapura. Vortex e centrifugare brevemente la provetta. Ripetere il punto 5.4.1.2 fino all'ultimo tubo nella diluizione in serie ha ricevuto plasmide. Trasferire 5 ml di ogni diluizione del plasmide a 2 tubi con 135 ml di materiale risorsa negativa per ottenere 2 replica per le 6 norme positive. Vortex e centrifugare brevemente. Eseguire l'estrazione dei 2 repliche per le 6 norme positive, come descritto nella sezione 1. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Determinare la zona di abbattimento: la zona tra l'ultimo concentration di plasmide dare un segnale positivo e la prima concentrazione che mostra alcun segnale. Limite di rilevazione del metodo (LOD Method) determinato da 2 prove indipendenti Nota: Eseguire 2 studi indipendenti per determinare il limite di rilevazione del tutto il metodo (LOD Method). Avviare i 6 diluizioni seriali a due-fold con la diluizione di lavoro plasmide che è 4 volte più concentrato che l'ultima concentrazione del plasmide che ha dato un segnale positivo (vedi paragrafo 5.4.1.5). Dispensare 25 ml di acqua ultrapura a 6 tubi. Eseguire 5 diluizioni seriali duplici del plasmide. Trasferimento 25 microlitri dalla diluizione plasmide di lavoro (determinato al punto 5.4.2.1) alla provetta con 25 ml di acqua ultrapura. Vortex e centrifugare brevemente la provetta. Ripetere il punto 5.4.2.3 fino all'ultimo tubo nella diluizione in serie ha ricevuto plasmide. Trasferire 5 ml di ogni diluizione dei Plasmid a 4 tubi con 135 ml di materiale risorsa negativa per ottenere 4 repliche dei 5 standard positivi. Vortex e centrifugare brevemente i tubi. Eseguire l'estrazione delle 4 repliche per le 5 norme positive, come descritto nella sezione 1. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Ripetere i punti 5.4.2.1 a 5.4.2.5, una volta per ottenere 8 repliche per ogni livello di concentrazione plasmide. Contare il numero di repliche positive su 8 repliche per ogni livello di concentrazione plasmide. Determinare il metodo LOD. Il metodo LOD è l'ultimo livello a cui 8 repliche su 8 repliche sono positivi (come descritto nella sezione 5.4.2.7). Gamma di linearità e limite di quantificazione del metodo analitico intero Nota: per determinare il limite di quantificazione di tutto il metodo di (LOQ Method), aggiungere concentrazioni note del plasmide al biologicocampioni che sono noti per essere liberi del target (EHV-2 in questo caso). Questi campioni costituiscono norme positivi per determinare il metodo LOQ. Dispensare 45 ml di acqua ultrapura a 6 tubi. Eseguire 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide. Transfer 5 microlitri dalla diluizione di lavoro plasmide corrispondente a 10 7 Metodo LOD (come determinato nella sezione 5.4.2.8) al tubo con 45 ml di acqua ultrapura. Vortex e centrifugare brevemente la provetta. Ripetere il punto 5.5.2 fino all'ultimo tubo nella diluizione in serie ha ricevuto il plasmide. Trasferire 5 ml di ogni diluizione del plasmide a 2 tubi con 135 ml di materiale risorsa biologica negativo per ottenere 2 repliche delle 6 norme positive. Vortex e centrifugare brevemente. Eseguire l'estrazione dei 2 repliche per le 6 norme positive, come descritto nella sezione 1. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Ripetere i punti 5.5.1a 5.5.4 tre volte. Definire un profilo di precisione al fine di valutare e convalidare le prestazioni quantitativa del metodo. Definire i limiti di accettabilità di tutto il metodo per il laboratorio. In questo protocollo, i limiti di accettabilità sono definiti come ± 0,75 log 10 dal Labeo Frank Duncombe. Per una prova, tracciare un primo regressione lineare y = ax + b (a è l'inclinazione e b è l'intercetta) con una replica dei valori Ct corrispondente a ciascun valore stimato della curva standard. Con questo primo regressione lineare, calcolare il valore sperimentale del numero di copie per i replicati di valori Ct utilizzati per questa prima curva standard. Ripetere passaggio 5.5.5.2 con le seconde replicati di valori Ct per ottenere una seconda regressione lineare e calcolare il valore sperimentale del numero di copie per il secondo replicati di valori Ct utilizzati per la seconda curva standard. <li> Ripetere il passaggio 5.5.5.2 con la seconda e terza prova. Calcolare i limiti di precisione, esattezza e precisione per ogni livello plasmide secondo il NF U47-600-2 12. Creare un foglio di calcolo per compilare le informazioni per tutti i punti standard (5.5.5.4) e creare un profilo di precisione con i limiti di accettabilità precedentemente definite in 5.5.5.1 e la veridicità dei dati con il più basso e il limite di accuratezza superiori calcolato in 5.5 .5.4 (Figura 5). Determinare il metodo LOQ: ciò corrisponde alla più bassa concentrazione di una curva standard con esattezza 0,75 log 10 ed usati per il campo di linearità calcolata in 5.5.5.5. La valutazione di ripetibilità e riproducibilità Nota: Controllare la ripetibilità e riproducibilità utilizzando il rapporto tra la deviazione standard e la media delle misurazioni ripetute (coefficiente di variazione o CV = deviazione standard /significare). Valutare la ripetibilità del metodo insieme con 1 Analista: Scegli 3 campioni biologici con 3 distinti carichi genoma virale (precedentemente testato in PCR, per esempio). Estrarre 8 repliche dei 3 campioni come descritto nel paragrafo 1. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Calcolare la media e la deviazione standard del valore Ct raccolto per ciascun campione. Calcolare il CV intra-saggio con la formula CV = deviazione standard / media. Valutare la riproducibilità del metodo intero da 3 Analisti: Scegli 3 campioni biologici con 3 distinti carichi genoma virale (precedentemente testato in PCR per esempio) Estrarre 2 replicati di 3 campioni scelti a 5.6.2.1 (come descritto nella sezione 1). Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Ripetere i passaggi da 2 5.6.2.2 analisti indipendenti. Calcolare la media e la deviazione standarddel valore Ct raccolto per ciascun campione. Calcolare il CV inter-saggio con la formula CV = deviazione standard / media.

Representative Results

Il metodo RT-PCR, come descritto sopra, è stata implementata per rilevare e quantificare equid herpesvirus-2 nei fluidi respiratori. Figura 1 illustra un diagramma di flusso schematico per lo sviluppo e la validazione di un metodo RT-PCR secondo la norma AFNOR NF U47-600. Specificità dei primer e sonde sono stati convalidati durante lo sviluppo passo-passo del PCR. Solo EHV-2 ceppi sono stati amplificati in questo sistema. Successivamente, le prestazioni della qRT-PCR doveva essere caratterizzata. In primo luogo, per stimare il LOD PCR, una diluizione seriale 6 dieci volte è stato eseguito per determinare la zona di abbattimento (Figura 2). In questo esempio, 6 diluizioni seriali dieci volte sono state fatte tra il 10 e il 10 -5 -10 (tra 26.000 e 0,26 copie / ml 2,5 di esempio) per stimare il LOD PCR. La zona di abbattimento li tra diluizioni di 10 -9 e 10 -10 (tra 2,6 e 0,26 copie / ml 2,5 di esempio). Per determinare il valore di LOD PCR in questo caso, 6 diluizioni seriali duplici del plasmide sono stati fatti in questa zona di abbattimento tra 5.2 e 0,16 copie / 2,5 microlitri del campione. Il valore di LOD PCR è stato di 2,6 copie / ml 2,5 del campione. Per determinare il campo di linearità e LOQ PCR, il valore di LOD PCR è stato utilizzato per avviare la gamma di 6 diluizioni seriali dieci volte, tra 2,6 (LOD PCR) e 260.000 copie / 2,5 campione ml. La Figura 3 illustra una regressione lineare per la EHV2 qRT-PCR da uno studio. Le prestazioni di regressione lineare (Figura 4) sono convalidati in quadruplicato utilizzando i calcoli descritti nella Tabella 3. I calcoli vengono eseguiti per definire l'intervallo di linearità secondo i criteri assoluta Bias i value ≤0.25 log 10, qualunque sia il livello di carico i plasmide. In questo caso, la linearità gamma giaceva tra 2.6 e 260.000 copie / ml 2,5 del campione. Il LOQ PCR è la concentrazione più bassa nel range di linearità (cioè, 2,6 copie / 2,5 microlitri del campione in questo caso). U LIN è stata determinata da 0,12 log 10 nella gamma 2.6-260,000 copie / 2,5 ml di DNA. Dopo lo sviluppo (figura 1, blu) e caratterizzazione del qRT-PCR (Figura 1, giallo), il U47-600 norma AFNOR NF raccomanda caratterizzazione dell'intero metodo analitico da estrazione del DNA da qRT-PCR (Figura 1, arancione). La sensibilità e specificità diagnostica sono stati calcolati come descritto in Tabella 4. Le prestazioni quantitative dell'intero metodo analitico qRT-PCR è stata valutata e convalidati con un profilo di precisione ( <strong> Figura 5). Questo protocollo, che utilizza la tecnologia molecolare state-of-the-art, ci ha permesso di rilevare e quantificare il carico genoma EHV-2 virale in 172 campioni di tampone nasale ottenuti da cavalli con disturbi respiratori e / o sospetto clinico di infezione. L'incidenza di EHV-2 dal campo campioni (biologici) è stata del 50% (86/172) in questa popolazione. Le analisi quantitative hanno mostrato che virali carichi genoma di EHV-2 erano significativamente più alti nei giovani cavalli e la ripartizione dei carichi genoma virale è diminuita con l'età (Figura 6). Nel presente studio, il più alto EHV-2 carico genoma virale (1,9 x 10 11 copie / ml) è stata rilevata nei puledri (Figura 6). Figura 1: Diagramma del flusso di lavoro per lo sviluppo (blu), la caratterizzazione del RT-PCR quantitativa(giallo) e la caratterizzazione dell'intero metodo analitico da estrazione del DNA da qRT-PCR (arancione) secondo la norma AFNOR NF U47-600-2. Il grafico workflow riprende le fasi per lo sviluppo, la caratterizzazione della RT quantitativa -PCR e la caratterizzazione dell'intero metodo analitico da estrazione del DNA da qRT-PCR. Per ogni passo, il grafico del flusso di lavoro indica il numero di corse necessarie, diluizioni da eseguire e il numero di analisti richiesti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2: Determinazione della zona di abbattimento con risultati rappresentativi curve PCR in tempo reale ottenuti con 6 diluizioni seriali dieci volte di plasmide. Per stimare la zona di abbattimento, di serie 6 di dieci voltediluizioni sono fatte tra il 10 -5 (26.000 copie / ml 2,5 del campione) e 10 -10 (0,26 copie / 2,5 ml del campione). La zona di abbattimento si trova tra diluizioni di 10 -9 (2,6 copie / ml 2,5 del campione) e 10 -10 (0,26 copie / 2,5 ml del campione). In questo caso, 6 diluizioni seriali duplici di plasmide sono state effettuate in questa zona di abbattimento per determinare il livello di dettaglio del 95% di PCR, tra il 5,2 e 0,16 copie / ml 2,5 del campione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3:. Regressione lineare per EHV2 qRT-PCR La linearità del test quantitativa è la capacità di generare risultati che sono proporzionali alla concentrazione del bersaglio presente in un intervallo specifico. Questo può essere modellatoregressione lineare (y = ax + b) tra il (soglia di ciclo o Ct) risposta strumentale e il logaritmo della quantità del target (numero di copie di destinazione / 2,5 campione mL). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura . Figura 4:. Prestazioni di regressione lineare di EHV-2 qPCR media pregiudizi rappresentano la differenza media tra la quantità plasmide misurata ( ) E la quantità teorica plasmide (x 'i) per ogni livello plasmide. Le barre verticali rappresentano l'incertezza di linearità (U Lini) dato dalla formula dove SD'i è la deviazione standard o f quantità plasmide misurata. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5:. Profili di precisione in base ai risultati della convalida del metodo EHV-2 qRT-PCR La linea verde (cerchi) rappresenta la veridicità dei dati (errore sistematico, o bias). I limiti di accettabilità sono definiti a ± 0,75 log 10 dal laboratorio (linee tratteggiate). I limiti di precisione inferiore e la parte superiore sono stati determinati per ciascun livello di carico plasmide dalla polarizzazione media ± due volte la deviazione standard dei dati di affidabilità (linee rosse). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. 1 "> Figura 6:. Quantificazione dei carichi genoma virale di EHV-2 in base all'età La distribuzione del carico virale genoma di EHV-2 rilevati nei campioni di tampone nasale è rappresentato per le diverse fasce di età. Le linee orizzontali rappresentano i valori medi entro la deviazione standard (m = mesi). * Significativamente diverso da ANOVA con test post-hoc di Newman-Keuls (p <0.05). Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura. gene bersaglio Primer, sonde e plasmide sequenze (5'-3 ') posizione nucleotide Dimensioni del prodotto (nucleotidi) <strong> condizioni cicli termici Riferimenti EHV2 gB (HQ247755.1) Avanti: GTGGCCAGCGGGGTGTTC 2113-2130 78 95 ° C 5 min 11 Reverse: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA 2189-2170 95 ° C 15 sec 45 cicli Sonda: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB 2132-2157 60 ° C 1 min plasmidi: ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG 2081-2381 Tabella 1:. Sequenze di primer, sonde e controlli positivi DNA sintetici utilizzati in questo protocollo La sequenza di plasmide (DNA sintetico positivo) corrisponde al nucleotide posizioni 2081-2381 della sequenza EHV2gB (HQ247755.1). La progettazione di primer e sonde utilizzate in questo protocollo è stata ottenuta utilizzando un software specifico. PATHOGENS Riferimento (origine) Numero di ceppi RISULTATI EHV-2 EHV-2 VR701 (ATCC) <td rowspan class = "2"> 20 Positivo 20 campioni (raccolta FDL) EHV-5 KD05 (Vincitore campionato tedesco) 20 Negativo 20 campioni (raccolta FDL) EHV-3 VR352 (ATCC) 2 Negativo T934 WSV (Vincitore campionato tedesco) EHV-1 ceppo Kentucky Ky A (ATCC) 3 Negativo 2 campioni (raccolta FDL) EHV-4 VR2230 (ATCC) 1 Negativo Asinine herpesvirus AHV5 FDL Collection 1 Negativo equinoInfluenza Virus A / equina / Jouars / 4/2006 (H3N8) 1 Negativo (Adesione Number JX091752) Equine Arterite Virus VR796 (ATCC) 2 Negativo Rhodococcus equi FDL Collection 1 Negativo Streptococcus equi subsp. zooepidemicus FDL Collection 1 Negativo Streptococcus equi subsp. equi FDL Collection 1 Negativo Coxiella burnetii ADI-142-100 (Adiagene) 1 Negativo Chlamydophila abortus ADI-211-50 (Adiagene) 1 Negativo Klebsiella pneumoniae FDL Collection 1 Negativo Tabella 2: la specificità analitica di qRT-PCR per EHV-2. Tabella 3: Calcolo dell'incertezza pregiudizi e linearità (adattato da NF U47-600-2 12). Per ogni prova, le prestazioni di regressione lineare (y = ax + b) vengono convalidati utilizzando la tabella dove y è la soglia ciclo ottenuti; a è l'inclinazione ottenuto,. X è il livello di plasmide e b è l'intercetta i è il plasmide livello (i varia da 1 a livelli k), k è il numero di livelli plasmide utilizzato (ad esempio, k = 6 in tla tabella), j è la prova (j varia da 1 a prove I), che è il numero di prove, compreso tra 3 e 6 studi (ad esempio I = 4 in questa tabella) x i è la quantità plasmide stimato per ciascuna. i plasmidi livello. x 'i è la quantità teorica plasmide ottenuto con l'equazione x' i = log 10 (x i) per ogni i plasmide livello. Durante ogni prova j, il ciclo soglia ottenuta per ogni i Livello plasmide viene calcolato con la regressione lineare y i, j = a j x i, j + b j. è la quantità plasmide misurato durante la j processo. Bias i </sub> è la differenza osservata tra la quantità plasmide misurata e la quantità plasmide teorico per ogni prova e ogni livello plasmide. è il valore medio di per ogni i plasmidi livello; SD 'i è la deviazione standard della grandezza misurata per ogni i livello di plasmide, media bias è la media di Bias i; U Lini è l'incertezza linearità determinata per ogni i plasmidi livello calcolato dal SD'i e intendo pregiudizi. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. 1 "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-con-next.within-page =" always "> lo stato reale del campione Positivo Negativo I risultati ottenuti con il metodo intero Positivo RP (reale positivo) FP (falso positivo) Negativo FN (falsi negativi) RN (reale negativo) Totale RP + FN FP + RN Se = RP / (RP + FN) Sp = RN / (RN + FP) Tabella 4:. Calcolo della sensibilità diagnostica (Se) e specificità (Sp) dell'intero metodo di una tabella Schwartz stato utilizzato per calcolare il confidIntervallo za al 95% di sensibilità e specificità di tutto il metodo descritto in NF U47-600-2.

Discussion

Dal momento che il 2000, PCR in tempo reale è stato sostituendo le tecniche d'oro standard (colture cellulari e metodi di batteri cultura) in un numero crescente di laboratori. L'attuazione della tecnica è relativamente facile. Tuttavia la convalida dei metodi di laboratorio è essenziale per la diagnosi molecolare e la quantificazione di agenti patogeni per garantire dati precisi, ripetibili e affidabili.

Poiché la fase di estrazione è la fonte primaria di perdita di materiale biologico, può essere considerata la principale fonte di errore di quantificazione tra un protocollo e un altro. Come tale, la creazione di una curva standard di plasmide DNA durante qRT-PCR, riportati principalmente in letteratura, indica il carico genoma virale, ma non tiene conto della fase di estrazione.

Descrizione di una strategia de novo di un intero processo metodo di convalida nella norma AFNOR NF U47-600-2 rappresenta un significativo progresso in questo settore. Come illustrato inquesta carta per EHV-2 in cavalli o da altri in api 21, questo richiede chiara differenziazione tra la fase di sviluppo e la fase di validazione con caratterizzazione della PCR e caratterizzazione dell'intero metodo. Una limitazione di questo approccio interessante è che qualsiasi modifica del protocollo comporterà l'obbligo di rinnovare il processo completo che può essere molto costoso. Questa limitazione è stata evidenziata anche dal fatto che i confini di quantificazione dipendono dalla sorgente dalla quale il virus viene estratto (ad esempio, fluidi respiratorie, organi, sangue o urina). Infatti, ogni matrice presenta differenti specificità nelle loro caratteristiche fisico-chimica ed è importante per definire in modo indipendente ciascuna matrice differente utilizzato per il rilevamento virale e quantificazione per qRT-PCR. Così, il carico genoma virale di ogni campione biologico può essere quantificata più precisamente dall'estrazione. La caratterizzazione tiene conto anche il mod termociclatoreel e quando l'uso di un metodo precedentemente ben caratterizzato (per esempio, il metodo EHV-2 qPCR descritto in questo documento) richiede un nuovo tipo di macchina in laboratorio genitore o altro laboratorio, si deve confermare l'efficacia di tale strumento. La conferma delle prestazioni di un saggio qPCR è un prerequisito per tutte le prove mettono in un laboratorio. Ciò si ottiene normalmente analizzando un campione di riferimento con proprietà note. Tale assegno è un prerequisito e considerato obbligatorio come richiesto dalla norma NF 47-600-1 AFNOR al fine di convalidare le prestazioni del (efficienza LOD, LOQ) qPCR e la robustezza del tutto il metodo (LOD, LOQ). Non solo durante le fasi di sviluppo e caratterizzazione ma anche quando utilizzato nella ricerca o per scopi diagnostici, i fattori di rischio possono essere identificati e ben controllato per assicurare la standardizzazione del protocollo. Di particolare interesse è adeguata formazione del personale, personale altamente qualificato, il controllo di qualità dei materiali di consumousati e il loro stoccaggio, il controllo delle condizioni ambientali immediati e la consapevolezza delle condizioni metrologiche che possono influenzare le prestazioni degli strumenti scientifici coinvolti nel test. L'utilizzo di campioni di riferimento per i confronti interlaboratorio potrebbe anche contribuire a controllare le incertezze. In questo modo, il confronto dei dati tra laboratori può essere facilitata. Infatti, prove di competenza interlaboratorio sono essenziali per valutare e confermare la riproducibilità del metodo.

Virali risultati carico del genoma che sono espressi in unità internazionali (UI) della matrice biologica analizzato (UI: copie / ml per i liquidi o copie / g per i tessuti) sono più facili da utilizzare al fine di confrontare i risultati tra i diversi laboratori. Tutti i risultati di cui sopra il LOQ sono espressi come copie / ml e di conseguenza tra il LOD e LOQ è preso come un risultato non quantificabili positivo. Presentando i dati quantificational del genoma in questo modo si conforma più precisamente alle process di analisi (amplificazione del genoma). Infatti, in esperimenti di coltura cellulare, espressione del carico virale TCID50 (tessuto mediana cultura infettiva dose) dipende dalla natura delle cellule e ceppi di virus. Ogni linea ceppo possiede la sua cinetica di infezione unico ed alcuni virus come EHV-2 può richiedere diversi giorni prima che il primo effetto citopatico è evidente.

In conclusione, questo nuovo metodo di caratterizzazione di qRT-PCR dovrebbe facilitare l'armonizzazione della presentazione dei dati e l'interpretazione tra i laboratori. Questo sarà molto utile per nuove applicazioni potenziali di qRT-PCR in futuro, come la creazione di un valore di cut-off per la dichiarazione dello stato di malattia anziché solo la presenza o l'assenza del patogeno.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Sophie Castagnet and Nadia Doubli-Bounoua for their technical support. This work received financial support from the General Council of Calvados and the agreement of Region Basse-Normandie and French Government (CPER 2007-2013; project R25 p3). The authors would like to thank the experts of the AFNOR group and particularly Jean-Philippe Buffereau and Eric Dubois.

Materials

AB-1900 natural color ABgene 96 well plate  Dutsher 16924
Adhesive film QPCR Absolute  Dutsher 16629 Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run
0.5 mL microtubes, skirted, caps Dutsher 039258
Ethanol 98% Sodipro SAF322941000
Primers Eurofins Custom order
Probe Life Technologies Custom order
Plasmid Eurofins Custom order
QIAamp  RNA viral Mini Kit
(containing: QIAamp Mini column, AVL  buffer,  AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) 		 Qiagen 52906 AVL buffer: pre-warm 5 min at 72°C
Sequencing by Sanger method Eurofins Custom order
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4364340
Tris-EDTA buffer solution Santa Cruz sc-296653A
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermoscientific ND-2000C
StepOnePlus Real-Time PCR systems Life Technologies 4376600 pre-warm 15 min 
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Referencias

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Hue, E. S., Fortier, C. I., Laurent, A. M., Quesnelle, Y. F., Fortier, G. D., Legrand, L. J., Pronost, S. L. Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids. J. Vis. Exp. (109), e53672, doi:10.3791/53672 (2016).
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