تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة
Summary
ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لأداء الكمية، وحيدة الخلية في التحليل الموقعي للتعبير البروتين لدراسة مواصفات النسب في أجنة الفئران قبل الغرس. الإجراءات اللازمة لتحصيل الكيسات الأريمية، بكل جبل كشف مناعي للبروتينات، وصفت التصوير العينات على المجهر متحد البؤر، وتجزئة النووية وتحليل الصور.
Abstract
ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لأداء الكمي، واحدة من الخلايا في الموقع تحليلات التعبير البروتين لدراسة مواصفات النسب في الأجنة قبل الغرس الماوس. ووصف الإجراءات اللازمة لتحصيل الجنين، المناعي، والتصوير على المجهر متحد البؤر، وتقسيم الصور وتحليلها. وتسمح هذه الطريقة الكميات من التعبير عن علامات نووية متعددة والمكانية (XYZ) تنسق جميع الخلايا في الجنين. ويستفيد من MINS، أداة البرمجيات تجزئة الصورة وضعت خصيصا لتحليل الصور مبائر من الأجنة قبل الغرس والخلايا الجذعية الجنينية المستعمرات (ESC). MINS ينفذ تجزئة النووية غير خاضعة للرقابة عبر X، Y و Z الأبعاد، وينتج من المعلومات حول موقف خلية في الفضاء ثلاثي الأبعاد، فضلا عن مستويات مضان النووية لجميع القنوات مع إدخال المستخدم الحد الأدنى. في حين تم تحسين هذا البروتوكول لتحليل الصورمن سابق للانغراس الأجنة مرحلة الماوس، ويمكن بسهولة أن تتكيف مع تحليل أي عينات أخرى اظهار جيدة نسبة الإشارة إلى الضوضاء وحيث الكثافة النووية العالية تشكل عقبة أمام تجزئة الصورة (على سبيل المثال، تحليل التعبير عن الخلايا الجذعية الجنينية (ESC ) المستعمرات، تمييز الخلايا في الثقافة والأجنة من الأنواع أو في مراحل أخرى، وما إلى ذلك).
Introduction
جنين الفأر سابق للانغراس هو نموذج لدراسة نشوء وصيانة تعدد القدرات في الجسم الحي، وكذلك نموذجا لدراسة مواصفات مصير الخلايا ودي نوفو الاندمال بتشكل النسيج الظهاري في الثدييات. حريصون على مراحل سابق للانغراس التنمية الثدييات لإنشاء الأنساب الخلية الثلاثة التي تشكل الكيسة الأريمية، وهي الأديم الظاهر المحفزة – الذي يؤدي إلى معظم الأنسجة الجسمية والخلايا الجرثومية – واثنين من الأنساب خارج الجنين، الأديم الظاهر الغاذي (TE) و الأديم الباطن البدائي (قبل) (الشكل 1A) 1،2. يصف هذا البروتوكول إجراءات ل(1) الأجنة الحصاد وتحديد المرحلة سابق للانغراس الماوس، (2) أداء المناعي لتسمية البروتينات من الفائدة، (3) تنفيذ كامل جبل التصوير باستخدام المجهر متحد البؤر مع قدرات باجتزاء ض و (4) أداء تجزئة النووية من الصور مبائر ويحلل صورة الكمية اللاحقة. هذا الخط يسمح رانه متحيز قياس مستويات البروتين لتعيين هوية الخلية لوصف مجموعات سكانية فرعية من الخلايا في الموقع. يمكن أن يتم هذا البروتوكول في اقل من 3-4 أيام للحصول على القمامة واحدة (عادة ما يصل الى 10 أجنة الفئران)، من جمع الأجنة لتحليل البيانات (الشكل 1B). إن التحليل المتزامن لعدة جراء زيادة التصوير وتحليل البيانات عبء الزمن، وبالتالي تمديد الطول الإجمالي للبروتوكول.
الجنين قبل الغرس مرحلة الماوس هو نظام لين العريكة تجريبيا التي، نظرا لصغر حجم والتشكل النمطية 3، هي مناسبة تماما لفي التصوير توتو من العمليات الخلوية لقرار وحيدة الخلية. لإجراء وتحليل غير متحيز على مستوى نظم عدد هام إحصائيا من الأجنة، وهو خط أنابيب التحليل الكمي الآلي هو مرغوب فيه. ولكن نظرا لكثافة النووية عالية من الكتلة الخلوية الداخلية (ICM) من الكيسة الأريمية ( <stرونغ> الشكل 1A، 2D) ومنصات تقطيع الصورة التقليدية تفشل في توفير دقة كافية لإنشاء سير العمل الآلي أو شبه الآلي. من ناحية أخرى، وتجزئة اليدوية، في حين دقيقة، لا يسمح تجهيز أفواج كبيرة من الخلايا والأجنة، كما أنها مناسبة لاستنساخه، تقرير متحيز الهويات الخلية – وهو أمر بالغ الأهمية عند دراسة مراحل النمو حيث أنماط علامة والتعبير لم تحل بالكامل (على سبيل المثال، لا تظهر توزيع ثنائي عبر السكان). لقد وضعت مؤخرا والتحقق من صحة طريقة تقطيع الصورة مصممة لأجنة المرحلة الماوس سابق للانغراس والخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) الذي يحقق دقة عالية، في حين تتطلب إدخال الحد الأدنى المستخدم 4-8.
خط أنابيب التحليل المقدم هنا يدور حول أداة تقطيع الصورة مقرها MATLAB-وحدات التفاعلية الإنقسام النووية (دقيقة) 4. MINS صerforms تجزئة النووية غير خاضعة للرقابة على دفعات كبيرة من مبائر Z-مداخن بعد أنشأت المستعمل أقل عدد ممكن من خصائص الصورة، وذلك باستخدام واجهة المستخدم الرسومية (GUI) (الجدول 1) (4). وقد ثبت هذا الخط فعالة لتوليد بيانات عالية الإنتاجية على التعبير البروتين وتوطين خلية في كل من النوع البري، وتعامل بشكل تجريبي والمعدلة وراثيا الأجنة والمجالس الاقتصادية والاجتماعية 5-7. في هذا البروتوكول، وصفنا تطبيق MINS إلى تقسيم الصور الجنين قبل الغرس المرحلة. للحصول على أمثلة من أداء MINS على المجالس الاقتصادية والاجتماعية، يرجى الرجوع إلى 4،7. الخطوة تجزئة النووية الآلي يقلل بشكل ملحوظ من عبء الوقت عملية تحديد الهوية الخلية، في حين أن قياسات كثافة المكانية ومضان تسمح للتقرير متحيز الهويات خلية وتوليد خرائط ثلاثية الأبعاد من مجالات التعبير الجيني وموقف الخلايا في الجنين (الشكل 1C </strong>). وعلاوة على ذلك، فإن قابلية هذا العمل يجعل من تطبيقها على تحليل الفضلات الفردية من خلال أفواج كبيرة من الأجنة تعامل تجريبيا، أو الأجنة من خلفيات وراثية مختلفة 5،6. MINS غير متاحة بحرية في http://katlab-tools.org (البرنامج يتطلب ترخيص MATLAB).
أي نهج ضعت حتى الآن يسمح للجيل هذه البيانات متعمقة بشأن تعبير البروتين وتوطين الخلايا في أجنة الفئران قبل الغرس. كل المحاولات حتى الآن في قياس هذه الأنواع من البيانات قد يقتصر على تقرير اليدوية والكميات من أرقام الهواتف المحمولة لمجموعات سكانية مختلفة في الجنين (إما كليا يدويا، أو البرمجيات بمساعدة) 9-19. وقد تم تصميم هذا النهج (دمج البرمجيات دقيقة) لواختبارها على الأجنة قبل الغرس الماوس والمجالس الاقتصادية والاجتماعية. ومع ذلك أدائها على أنظمة أخرى ذات الكثافة النووية عالية، على الرغم من بعد لم تختبر، ومن المتوقع أن يكون معادلا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة لإجراء التحليل الكمي من كامل جبل المناعي على سابق للانغراس الأجنة مرحلة الماوس. ويتبع بروتوكول المناعي القوي 22 من ذات الدقة العالية، كلها جبل التصوير متحد البؤر وتجزئة الصورة باستخدام قطعة مصممة من برنامج 4. في حين أن اختيار بروت?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
Referencias
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -. K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -. E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -. J., Hadjantonakis, A. -. K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -. K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
