효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리
Summary
This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.
Abstract
Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.
Introduction
접촉 성 피부염, 습진, 건선, 봉와직염, 비 흑색 종 피부암에 곰팡이 감염 및 농양에 이르기까지 피부 상태는 전세계 50 가장 널리 퍼진 질병들로 발견되었고 2010 1 치명적 질병의 네 번째 선도적 인 글로벌 원인. 따라서, 다양한 피부 병변을 기본 분자 및 세포 메커니즘의 조사 연구에 필요한 활성 영역입니다. 설치류 모델은 아토피 성 피부염 (2), (3), 건선, 또는 포도상 구균 감염 4 같은 염증성 피부 질환의 이해에 도움이 현저하게되어왔다. 마우스 피부 조직의 효소 적 소화, 저렴하고 효율적이며 간단한 프로토콜 나은 피부 질환의 병태 생리를 이해 하류 다양한 용도에 사용할 수있는 세포의 제제를 제공 할 수있다. 여기서, 간단하고 경제적 인 방법은 마우스 피부 효소에 대해 기재되어 다이제스트조직 및 세포 배양, 생체 대체 전송에 사용할 수있는 피부 침투 백혈구의 분리, 유세포 분석 및 분류 또는 유전자 발현 연구를 흐른다. 이 절차의 목적은 통상적으로 전체적인 맞춤 시약 키트 및 기계적 dissociators와 연관된 비용을 최소화하면서 높은 세포 생존율과 피부 백혈구 침윤의 단일 세포 현탁액을 제조하는 공정이다.
기존의 피부 조직 해리 방법 5-7 낮은 세포 생존 및 표면 마커의 무결성 결과, 또는 사용자 정의 효소 키트와 고가의 조직 해리 기계 8-11 필요할 수 있습니다. 마우스 귀 피부 조직의 소화가 합리적으로, 12 ~ 13 유행 높은 각화 피부 조직을 소화하는 동안 (예를 들면 측면에서) 비 세포 파편 많은 양의 오염 된 세포 준비가 발생할 수 있습니다. 최근의 연구에서, 자이드와 동료가 2.5 mg을 90 분 동안 마우스 측면 피부를 소화 / ㎖ 디스 파제, FOLLO3 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 (7)에 의해 45 분 결혼. 또 다른 연구에서, 이들 연구자들은 트립신 / EDTA, 콜라겐 III의 사용을 포함하는, 2.5 시간의 조합으로 여러 소화 배양을 사용하고, (5) 디스 파제. 다른 제조업체의 트립신으로 처리 잴 포유 동물 세포에서 14-15 세포 표면 단백질의 무결성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 트립신의 사용은 피부 효소 소화에 권장되지 않는다. 또한, 디스 파제는 CD4 및 CD8α T 세포의 증식 능력에 심각한 영향을 미칠 수 및 CD62L (16)와 같은 일반적인 T 세포 활성화 마커를 포함, 최소 20 분자의 표면 풍요 로움에 영향을 미칩니다. 다른 프로토콜은 소화 매체 (6)에 RPMI 1640을 사용합니다. 그러나, RPMI에 Mg2 +, Ca2 + 등의 존재는 광범위한 세포 응집 (17)가 발생할 수있다.
조직 분리를위한 이상적인 프로토콜은 높은 세포 생존 능력, 낮은 목표로한다세포 응집, 최소한의 손상의 수준은 표면 단백질을 세포합니다. 고품질 림프절 간질 세포 제제는 짧은 효소 배양, 칼슘 및 마그네슘이없는 배지 2+ 프로토콜을 사용하여 수행하고, 트립신을 피하고 18 디스 파제되었다. 그러나, 이러한 유형의 프로토콜은 전체 마우스 피부의 해리에 대해 확립되지 않았다.
여기에서, 프로토콜은, 해리 분리 및 알레르겐 – 도전 마우스 옆구리 피부에서 피부 백혈구 침윤을 풍부하게 기재되어있다. 간략하게, 절제된 피부 소화 조직을 연화 초과 각질이나 지방 조직을 제거하기 위해 1 시간 동안 10 % 소 태아 혈청 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)로 미리 배양된다. 이것은 0.7 mg을 함께 30 분간 효소 분해 단계 뒤에 / ㎖의 콜라게나 D. 콜라게나 D 그것을 만드는 최소 세포 표면 마커의 농도에 대한 영향, 및 시험관 (16, 18)에서 T 세포 증식에는 영향을주지표면 단백질의 특성을 포함하는 애플리케이션에 매우 적합하다. 효소 분해 후, 불연속 밀도 구배 원심 분리는 단일 세포 현탁액으로부터 상피 세포 및 잔해를 제거하고, 조혈 세포 농축 하였다. 중요한 것은,이 절차는 비싼 열 기반 자기 세포 분리 시약 및 티슈 기계 8-11 해리를 방지하고 기본 생의학 연구소에 위치한 재료 및 장비로 수행 될 수있다. 여기에서이 프로토콜 (19 각색) 이전에 감응 ND4 스위스 쥐 합텐 옥사 졸론 (황소)와 측면 피부에서 도전 세번 백혈구를 분리하는데 사용 하였다. 세포는 파라 메트릭 멀티 – 유동 세포 계측법을 사용하여 분석 하였다. 이 기술은 최소한의 파편과 계측법 영향 SK에 T 림프구와 호중구의 침윤을 측정하기 위해 파라 메트릭 다중 흐름으로 분석 하였다 격리 림프구의> 95 %의 생존율을 가진 세포 현탁액을 수득에서.
Protocol
Representative Results
Discussion
이러한 아토피 성 피부염이나 건선과 같은 피부 질환의 설치류 모델에서 피부에 상주하는 백혈구의 변화를 특성화하는 염증 세포의 유입과 질병 병리 사이의 기계적 연결을 이해하는데 중요하다. 여기에서 우리는 대부분의 생물 의학 연구 실험실에서 발견되는 기본 장비로 피부 조직에서 백혈구를 분리하는 경제적 인 방법을 설명합니다. 이 상대적으로 빠른 기술은 실험실 벤치에서 시간에 손?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
국립 보건원 (DC에 NIH R15 NS067536-01A1), 국립 Vulvodynia 협회 (DC에 수상), 그리고 매 켈리 스터 대학교는이 작업을 지원했다. 인증 기관은 아놀드와 로벨 베크 재단 자금 매 켈리 스터 대학교 베크 학자 프로그램에서 교제를 받았다. BTF 및 TM은 JDRF 2-2011-662 지원합니다. 우리는 기술적 조언 박사 제이슨 Schenkel 박사 줄리아 루이스 감사, 그들의 도움과 지원에 대한 Chatterjea 랩의 모든 현재의 전 멤버.
Materials
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3e-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8a-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
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