Precauções de segurança e Procedimentos Operacionais em um (A) de laboratório BSL-4: 2. Práticas Gerais
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
Trabalho em um laboratório de contenção biossegurança nível 4 (BSL-4) requer tempo e uma grande atenção aos detalhes. O mesmo trabalho que é feito em um laboratório BSL-2 com patógenos sem alto consequência vai demorar muito mais em um ambiente BSL-4. Este aumento da exigência de tempo é devido a uma multiplicidade de factores que visam proteger o pesquisador da infecções adquiridas em laboratório, o ambiente de trabalho de contaminação potencial e da comunidade local da possível libertação de patógenos de alta-consequência. Dentro do laboratório, o movimento é restrito devido a mangueiras de ar ligados aos ternos de segurança de corpo inteiro obrigatórios. Além disso, a desinfecção de cada artigo que é removido armários de segurança biológica de Classe II (BSC) é necessária. especialistas de laboratório deve ser treinado nas práticas de laboratório BSL-4 e deve mostrar alta proficiência nas habilidades que eles estão realizando. O foco deste artigo é descrever procedimentos e técnicas para garantir laboratório b adequadasiosafety e precisão experimental utilizando um ensaio de placa viral padrão como um procedimento de exemplo. Em particular, as técnicas adequadas para trabalhar com segurança em um ambiente de BSL-4 ao realizar um experimento será visualmente enfatizado. Estas técnicas incluem: a criação de um BSC Classe II em experiências, limpeza adequada do BSC Classe II, quando terminar o trabalho, gestão de resíduos e eliminação segura dos resíduos gerados dentro de um laboratório BSL-4, ea remoção de amostras inativadas de dentro de um BSL- 4 laboratório para laboratório BSL-2.
Introduction
Como a segurança do pessoal de laboratório de manipulação patógenos de alta-consequência (sem profilaxia de infecção nem opções de tratamento existe) é primordial, o Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos estabeleceu diretrizes para construção de instalações e melhores práticas para a condução segura do trabalho com patógenos em biomédica e laboratórios de análises clínicas, numa perspectiva de biossegurança 1. Através de legislação e regulamentação, muitas das práticas e procedimentos tornaram-se requisitos obrigatórios que devem ser seguidas para o trabalho com esses patógenos. Em os EUA, patógenos que são facilmente transmitidos de pessoa para pessoa, resultam em altas taxas de letalidade, e / ou têm o potencial de grande impacto na saúde pública e bioterrorismo, são categorizados como Instituto Nacional de Saúde / Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas doença (NIH / NIAID) a prioridade de um Pathogens e ou Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Bioterrorism da categoria A Agentes 2. Além disso, hpatógenos igh-conseqüência são classificados como nível 1 selecionar agentes se estes patógenos são agentes de bioterrorismo potenciais, têm potencial de mortes em massa ou efeitos devastadores para a economia, infra-estrutura crítica, ou a confiança pública 3.
BSL-4 operações, incluindo o acesso aos institutos com BSL-4 laboratórios, são mais altamente controlada do que BSL-2/3 operações. Por exemplo, é substancialmente mais difícil obter acesso a um laboratório BSL-4 em comparação com um laboratório BSL-2 ou BSL-3 devido a requisitos substanciais de formação terno, extensos requisitos de orientação e pré-requisitos de biossegurança médicos adicionais. Além disso, há normalmente barreiras de segurança mais físicas em uma facilidade BSL-4 versus uma BSL-2 ou NBS-3 facilidade 4-6. Conforme descrito no nosso primeiro artigo sobre procedimentos BSL-4 entrada e saída, pessoal de laboratório submetidos a treinamento e exames psicológicos para se qualificar para a entrada no laboratório BSL-4 7. Within laboratório BSL-4, risco de infecção e os erros são evitados ou reduzidos, seguindo os procedimentos estabelecidos. A pesquisa deve proceder com cuidado e deliberadamente, com multitarefa mínimo ou distrações. Curvando-se em ternos de pressão positiva é difícil, e o protetor facial pode restringir procedimentos como a microscopia. luvas de volumosas impedem o desempenho de tarefas motoras finas, como a manipulação de pequenos itens ou rotulagem tubos. Para minimizar o tempo gasto em BSL-4 laboratórios, especialistas de laboratório deve rever os procedimentos de trabalho para identificar as etapas que podem ser feitas com antecedência em um laboratório BSL-2 e, em seguida, transportar esses materiais para o laboratório BSL-4 para a conclusão da tarefa (s). Quando a remoção de materiais para posterior processamento em laboratório NB-2, os materiais são fixas e removidas do laboratório BSL-4 num contentor selado secundário. Exemplos de amostras que podem ter de ser removidos incluem: placas fixas ou tubos de material infectado que serão analisados por immunosorbe ligado a enzimaNT ensaio (ELISA), ensaio de imunofluorescência (IFA), ou reacção em cadeia da polimerase (PCR).
Além de maiores limitações físicas impostas pelo equipamento de protecção individual exigido na BSL-4 laboratórios, em comparação com aqueles em BSL-2 laboratórios, os procedimentos de inativação de patógenos de alta-consequência em placas de cultura de células e eliminação de resíduos são mais rigorosas do que as necessárias para vírus menos patogénicos estudado num laboratório de NBS-2. No mínimo, estes métodos devem cumprir o requisito CDC. Por exemplo, as placas de cultura de células contaminadas e outros materiais podem ser inactivados com reagentes químicos, tais como formalina neutra tamponada. placas ou tubos de cultura de células tratadas são para ser colocados em bolsas de vedação de calor contendo formalina e removido do laboratório através de um tanque de imersão cheia com um líquido desinfectante. As caçambas para resíduos preenchido com soluções desinfectantes e pulverizar desinfectantes são utilizados para receber temporariamente resíduos gerados durante o experimento e para DISInfecting luvas, limpeza de superfícies e instrumentos de cabine de segurança biológica, respectivamente. solução desinfetante de amônio quaternário, na concentração referida é considerada o padrão ouro para todos os US BSL-4 laboratórios (Barr J, comunicação pessoal, 2015). resíduos sólidos de um balde resíduos são autoclavados para eliminar potencial de contaminação.
Num esforço para demonstrar visualmente o fluxo de trabalho e as limitações gerais de procedimentos BSL-4, foi utilizado um ensaio de placas virais padrão como um exemplo de um procedimento virai utilizada. Enquanto o procedimento de ensaio viral é descrito em geral, destacamos os procedimentos de biossegurança utilizados para garantir a segurança do pessoal de laboratório neste protocolo. Por favor, consulte as visualizações ensaio de placa clássicos anteriores para o fundo adicional sobre a técnica 8,9 ensaio de placa.
Os procedimentos aqui apresentados seguem as especificações BMBL delineados pela CDC 1. No entanto, os protocolos são apresentadosespecífica para o IRF-Frederick. Cada instalação BSL-4 tem diferentes procedimentos operacionais padronizados (POPs) e métodos de operação que afetam a execução de experimentos em laboratório BSL-4. procedimentos alternativos para a gestão de fluxos de resíduos e execução de ensaios de placa pode variar de acordo com a gestão e operação desses laboratórios. No entanto, uma compreensão geral da instalação de um laboratório e procedimentos para a realização de trabalhos com a classe armários II dentro do ambiente BSL-4 terno BSL-4 vai ajudar os cientistas a entender as limitações e as implicações de segurança ao contemplar estudos de patógenos de alto risco. O aumento da conscientização de colaboradores exteriores das dificuldades que cercam o trabalho em um laboratório BSL-4 pode levar a expectativas ajustadas e maior facilidade no desenvolvimento de contramedidas médicas na comunidade de pesquisa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trabalho em um laboratório BSL-4 requer um tempo considerável e atenção adicional aos detalhes. Qualquer tipo de trabalho neste ambiente requer bem treinado, completa e indivíduos conscientes. O ensaio de placa viral norma fornece um modelo preciso de um procedimento comum para trabalhar com patógenos de alta-consequência no laboratório BSL-4, como o ensaio envolve vários conceitos importantes em que os trabalhadores de laboratório devem ser treinados.
A primeira grande conceito é…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
Referencias
- Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. , (2014).
- Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065 (2014).
- Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297 (2012).
- Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).
