CN-GELFrEE - Clear Inheems Gel-uitgewassen vloeibare fractie Entrapment elektroforese

De meeste biologische processen gebeurt in een cel worden bedacht door verzamelingen van eiwitten in plaats van één eiwit ¹ uit te voeren. Bijgevolg, om de specifieke biologische functie van een eiwit subeenheid ontrafelen in een cel is het noodzakelijk om de structurele interacties met andere eiwitten of liganden in complexen ² begrijpen. Echter, het bestuderen van eiwitten native, met behoud van hun niet-covalente interacties en de activiteit blijft uitdagend. Een tekortkoming van natief eiwit studies is een geschikt natief scheidingstechniek die compatibel is met verschillende stroomafwaartse eiwitanalyse technieken. Daarom heeft de recente interesse in scheidingstechnieken in staat is het karakteriseren van niet-covalente assemblages van biomoleculen fors ³ toegenomen.

Eiwit scheidingstechnieken zijn noodzakelijk om de biochemie, biofysica en diverse andere studies. Huidige inheemse scheidingstechnieken hebben intrinsic tekortkomingen die compatibiliteit te verminderen met downstream-analyses, zoals lage resolutie, lage omzet, verlies voor neerslag, en de eis van grote hoeveelheden van de eerste steekproef. Tandem affiniteitszuivering wordt gebruikt voor eiwit interactie studies, maar het moet afzonderlijk voor elk eiwit doel uitgevoerd, waardoor het onverenigbaar met high-throughput analyse ⁴ zijn. Gelpermeatiechromatografie ^5, selectieve precipitatie met ion affiniteitschromatografie ⁵ en dichtheid-gradiënt scheiding ⁶ hebben alle inheemse scheidingen voorzien, maar zijn inherent lage resolutie technieken en vereisen hoge initiële monster bedragen.

Alternatief gel gebaseerde technieken, zoals Blue inheemse (BN) en Clear Eigen (CN) PAGE (ofwel 1-D of 2-D), weergegeven hoge resolutie scheiding. Bovendien, contrasteren met andere technieken genoemd, zowel inheemse PAGE scheidingen behouden oplosbaarheid en inheemse conformatie van een brede range van macromolecuul species, waaronder hydrofobe eiwitten. Deze mogelijkheid verbreedt verder het proteoom dekking te bereiken met deze methoden ^7,8 en wordt bereikt door middel van verschillende chemie tussen CN en BN-PAGE. CN-PAGE berust gewoonlijk op zachte gebracht wasmiddelen als dragermoleculen, ter vervanging van de Coomassie Blue kleurstof in BN-PAGE. BN-PAGE, hoewel geassocieerd met een hogere resolutie, heeft kanttekeningen zoals verminderde enzymatische activiteit in de gescheiden eiwitten ⁸ en Coomassie molecule adduct formatie, waarbij de laatste zeer nadelig is voor downstream MS analyses ^9. Beide methoden zijn echter traditioneel geassocieerd met lage terugwinning en smalle proteoom dekking voor verkleuring en gelextractie beperkingen ^7.

Voor de studie van gedenatureerde eiwitten, zijn er verschillende technieken die macromolecule oplosbaarheid houden tijdens het uitvoeren van hoge-resolutie fractionering met eiwitrijke terugwinning en die verenigbaar zijn met diVerse nascheiding eiwit analysetechnieken. Gel geëlueerd vloeibare fractie Vangst Elektroforese (GELFrEE) is een van de fractionering technieken die al deze kenmerken passen. Deze methode wordt voornamelijk toegepast in high-throughput top-down proteomics studies, wat aangeeft dat het is snel en veelzijdig. In GELFrEE, eiwitten gedenatureerd en gescheiden op basis van molecuulgewicht door een buisvormige gelmatrix, kan de porositeit daarvan worden gevarieerd gebaseerd op monstervereisten en de gewenste fractionering resultaten. Fracties worden geëlueerd in de vloeistoffase, waardoor de terugwinning beperkingen geassocieerd met SDS-PAGE onder handhaving van hoge resolutie verminderen. Fractie fracties kunnen vervolgens met 1-D PAGE worden geanalyseerd op moleculair gewicht bandbreedte selectie ^11. Er is grote vraag naar de voordelen verbonden aan GELFrEE in inheemse scheidingstechnieken. De hierin beschreven werkwijze, Clear Indiaans GELFrEE (CN-GELFrEE), is een inwoner aanpassing van GELFrEE. Om compatibel met een breed s zijnpectrum van macromoleculen in hun natieve toestand, deze werkwijze berust niet alleen op de zachte CN-PAGE chemie, maar ook op een porositeit gradiëntscheiding, welk eiwit precipitatie vermindert door het elimineren van de ruwe overgang tussen poreusheid aanwezig discontinue gelsystemen ^9. Toegepast op eiwitcomplexen geëxtraheerd uit muizenhart fractioneren, weergegeven geëlueerde fracties hoge herstel en een hoge-resolutie scheiding van uiteenlopende molecuulgewichten werd verkregen. Verder zijn de verkregen fracties zijn compatibel met de meeste downstream biochemische en biofysische analyses eiwit.