Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis
Summary
The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.
Abstract
Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.
Introduction
El glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio en la retina 1. Las células ganglionares de la retina (CGR), que reciben la entrada sináptica glutamatérgica a partir de células bipolares 2, son las neuronas de salida de la retina que envían información visual al cerebro. Los estudios fisiológicos mostraron que la excitación sináptica de CGR está mediado por los receptores NMDA postsináptico (NMDAR) y los receptores de AMPA (AMPAR) 3,4,5. Aunque las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) en CGR están mediados por AMPAR y NMDAR EPSCs 3,5,6,7,8, miniatura espontáneas (mEPSCs) en CGR exhiben solamente un componente mediada por AMPAR 4,5,9. Sin embargo, la reducción de la captación de glutamato reveló un componente NMDAR EPSCs en 5 espontáneas, lo que sugiere que los NMDAR en las dendritas de CGR, pueden estar situados fuera de las sinapsis excitatorias. guanilato quinasas asociadas a la membrana (MAGUKs) como PSD-95 que los receptores de neurotransmisores clúster, incluidos los receptores de glutamato y del canal iónicos en los sitios sinápticos, también presentan distintos patrones de expresión subsináptica 10,11,12,13,14.
En las últimas décadas, la inmunohistoquímica confocal y pre-incrustación de microscopio electrónico de inmunohistoquímica (EM) se han empleado para estudiar la expresión del receptor de membrana. Aunque inmunotinción confocal revela patrones amplios de la expresión del receptor, su resolución más baja hace que sea imposible utilizar para distinguir localización subcelular. EM estudios pre-incrustación en la retina de mamíferos indican que las subunidades NMDAR están presentes en elementos postsinápticos en el cono bipolares sinapsis cinta celular 15,16,17. Esto está en contraste con aparente evidencia fisiológica. Sin embargo, la difusión de producto de reacción es un artefacto bien conocido en el método de inmunoperoxidasa pre-incrustación. Por lo tanto, este enfoque no suele dar datos estadísticamente fiables y puede excluir distinción entre la localización en la membrana sináptica frente 18,19,20,21 membrana extrasynaptic. EnPor otro lado, los datos fisiológicos y anatómicos son consistentes con una localización sináptica de AMPARs en CGR 3,5,7,9,22. Por lo tanto, los receptores de glutamato y MAGUKs en sinapsis cinta de la retina se localizan no sólo a la postsináptica, pero también a los compartimentos de membrana perisynaptic o extrasinápticos. Sin embargo, aún es necesario un análisis cuantitativo de alta resolución de estas proteínas de membrana en una sinapsis cinta de la retina.
Aquí, hemos desarrollado una técnica postembedding EM inmunoelectrónica para examinar la localización subsináptica de subunidades NMDAR, subunidades de AMPAR y PSD-95, seguido de la estimación del número, la densidad y la variabilidad de estas proteínas en las sinapsis Onto CGR de rata marcado utilizando la toxina del cólera subunidad B (CTB) métodos de rastreo retrógrado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito cuatro técnicas para el éxito post incrustar inmunoelectrónica EM cuantitativa: 1) la fijación corta y débil, 2) congelación-sustitución, 3) 4) la cuantificación posterior a la incorporación de tinción inmunoelectrónica, y.
EM inmunoelectrónica permite la detección de proteínas específicas en las secciones de tejido ultrafinas. Anticuerpos marcados con partículas de oro se pueden visualizar directamente mediante EM. Mientras potente en la detección de la local…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los programas internos del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación (NIDCD), de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Agradecemos a la instalación NINDS EM y el núcleo NIDCD avanzada de imagen (código # ZIC DC 000081-03) para obtener ayuda.
Materials
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutarldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultromicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1-1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4000 |
Referencias
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