Полуавтоматический подход к подготовке антител коктейли Иммунофенотипирование периферической крови человека
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
Иммунофенотипирование периферической крови методом проточной цитометрии определяет изменения в частоте и активации статуса лейкоцитов периферической во заболевания и лечения. У него есть потенциал, чтобы предсказать терапевтическую эффективность и определить новые терапевтические мишени. Всего окрашивание крови использует unmanipulated кровь, которая минимизирует артефакты, которые могут возникнуть во время подготовки образца. Тем не менее, вся окрашивание крови также должно быть сделано на свеже собранной крови, чтобы обеспечить целостность образца. Кроме того, лучше всего готовить коктейли антител в тот же день, чтобы избежать потенциальной нестабильности тандемных-красителей и предотвратить взаимодействие реагентов между блестящих фиолетовых красителей. Поэтому вся окрашивание крови требует тщательного стандартизации для контроля внутри и между экспериментальной изменчивости.
Мы сообщаем развертывание автоматизированной жидкой обработчика снабженную двумерной (2D) сканер штрих-кодов в стандартном процессе изготовления antibodу коктейли для проточной цитометрии. Антитела были перенесены в 2D со штрих труб, расположенных в формате 96-луночного и их содержание заносятся в базу данных. Жидкости обработчик может затем найдите флаконы источником антител, ссылаясь имена антител в базе данных. Наш метод устранены утомительной координации для позиционирования трубок источником антител. Это при условии, универсальность позволяет пользователю легко изменить любое количество деталей в процессе разлива антитела, такие как специфического антитела для использования, объема и назначения путем модификации базы данных без переписывания был установлен в способе обеспечения для каждого анализа.
Доказательство концепции эксперимента достигли выдающихся меж- и внутри- сходимость, продемонстрировал методом повторной подготовки 11-цветовой, 17-антитела проточной цитометрии. Эти методики увеличить общую пропускную способность для проточной цитометрии анализах и облегчается ежедневная Получение комплекса антитело коктейлей, необходимых для детального феноTypic характеристика свеже собранного антикоагулированной периферической крови.
Introduction
Иммунофенотипирование периферической крови человека определяет количественные и качественные изменения в иммунной клеточных подмножеств 1. Это дает представление о механизмах действия и сопротивления, открытий СПИД прогностических биомаркеров, и способствует развитию комбинированных иммунотерапии. Таким образом, проверка и стандартизация иммунофенотипирования является областью значительный интерес к академических исследователей, клинических лабораторий и промышленности.
Хотя иммунофенотипирования периферической крови методами проточной цитометрии, в настоящее время используется для клинического управления гемобластозами 2,3 и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) 4,5, надежного иммунофенотипирования периферической крови для требований иммунотерапии конкретных соображений в валидации и стандартизации, потому что это требует более широкое освещение над подмножеств иммунных клеток и активации / ингибирующих рецепторов 1,6-8. Successful иммунофенотипирования требует тщательного стандартизации, чтобы минимизировать изменчивость эксперимент-к-эксперимента, связанной с инструментальной и окрашивания клеток процедуры 9,10. В то время как стандартизация настроек прибора для проточной цитометрии хорошо известна по решению бывшего озабоченность 9,11,12, остается неясным, как свести к минимуму изменчивость, связанную с окрашиванием клеток, не ограничивая охват иммунных клеток подмножеств и их статус активации.
Поскольку число антигенов, которые будут обнаружены увеличивается, то же самое делает возможность ошибки и изменчивость вследствие неоптимального дозирования реагентов и перекрестного загрязнения. Методы phenoptypic анализа антикоагулированных цельной крови были созданы в конце 1980-х для использования в клинических лабораторных анализах. Эти же методы удовлетворения потребностей в научно-исследовательской лаборатории для пробоподготовки. Важно отметить, что коктейли антител, используемые в клинической лаборатории, как правило, менее сложной и AVAilable предварительно титруют и предварительно смешивают в производителя. Только один перенос коктейля предварительно смешанной антител требуется. В условиях исследования, антитела коктейли 10-16 антител являются типичными. Каждый коктейль должен быть подтверждено на стабильность путем лабораторных или приготовить свежую перед каждым анализом. Подготовка нескольких коктейли антител в образце может повлечь за собой пипетирования 50-80 отдельных антител, задачу, которая является одновременно утомительно и чревато ошибками.
Автоматизация приготовления коктейлей имеет ряд преимуществ перед ручной приготовления коктейлей, таких как меньшим количеством ошибок, повышение точности пипетки, и, возможно, даже снизилось реагента потерь. Мы сообщаем успешное внедрение автоматизированной жидкой обработчика снабженную двумерной (2D) сканер штрих-кодов в процессе клеточного окрашивание иммунофенотипирования минимизировать вариабельность, связанную с подготовке образцов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Иммунофенотипирование периферической крови является критически важным для получения понимание индивидуальных ответов на иммунотерапию. Задача заключается в стандартизации анализа для управления экспериментом к эксперименту изменчивости 1,14. Один главный источник изменчивости лежит в человеческом манипуляции образцов. Поэтому, можно предположить, что частичное или полное автоматизация обработки образцов будет способствовать резкое сокращение эксперимент-к-эксперимента изменчивости 1,14. В этом протоколе, мы сообщаем наше успешное усилия, чтобы минимизировать изменчивость анализа путем введения автоматизированной жидкого обработчик оснащенный 2D штрих-код читателя для образца окрашивания всей иммунофенотипирования крови.
В дизайне, наш метод является универсальным и может контролировать другие иммунные подмножества путем добавления дополнительных "база Коктейли", чтобы определить их. Такие подмножества включают Т-хелперы, Т регуляторные клетки, В-лимфоциты, NK-клетки, дендритные клетки, моноциты и (рукопись вПодготовка) 18. Мы адаптировали рекомендованные антител панелей консорциума путем введения дополнительных маркеров 1. клеточных популяций были определены с использованием "Base коктейль" конъюгированный с флюорохромами с минимальным излучением в блестящей фиолетовой 421 (BV421), фикоэритрин (PE), и аллофикоцианин (АРС) детекторы, как мы хотели, чтобы зарезервировать эти каналы для обнаружения индуцируемых антигенами. Эта функция не только обеспечивает высокую чувствительность для контроля состояния активации иммунных клеток, но также позволяет гибко размещение новых маркеров активации, как эти три флуорохромы наиболее часто сопряженную с антителами против индуцируемых маркеров. Поэтому наш метод подходит не только для приготовления коктейлей для всей иммунофенотипирования крови, но также полезно для окрашивания других образцов, включая одноядерных клеток периферической крови и клеток, выделенных из тканей с разбивкой (например, опухоль).
Успешное вступлениеводство нашего метода требует особого внимания к шагов в подготовке лабораторного оборудования и программирования и выполнение метода. Получение штрих-кодов трубок 2D включает маркировку с человеческими считываемые этикетки и передачи антител назначенным трубок. Чтобы предотвратить введение ошибок, мы рекомендуем делать это с двумя людьми. Всякий раз, когда меняется таблицы, следователи должны проверить работает ли метод правильно. Выбор соответствующих методов пипетки во программирования обеспечивает успешную передачу жидкости. LLS позволяет пипетирования без получения осажденного мусора со дна пробирки антител, для которых мы используем либо P50 или P200 проводящие советы. LLS не может быть хорошим выбором для P1000 советы, как LLS является более чувствительным с P1000 советы, а иногда ложно вызваны наличием пузырьков. Высоты в определении лабораторное должны быть скорректированы для каждого инструмента может произойти, как оптимальным перемещение жидкости, например, если нет достаточно места между краем советыа в нижней части труб. Как показано на рисунке 12, если "Базовый Коктейль" и / или "Активация Коктейль" не хорошо встряхивают, это может привести к нерациональному окрашивания.
Мы думали об использовании лиофилизированных реагенты для окрашивания клеток в качестве альтернативного подхода для снижения изменчивости, связанной с реагентом дозирования 19. Однако полимерные конъюгаты блестящих фиолетовых красителей известны взаимодействуют друг с другом, вызывающих неспецифические сигналов. Таким образом, при добавлении более двух полимерные конъюгаты (например, BV421 и BV650 и т.д.) в лиофилизированной реагентов могут привести к неспецифической сигнализации (например, увеличение BV650 фонового сигнала в BV421 + населения) 20. Кроме того, лиофилизированные реагенты не хватает гибкости для включения новых пятен. Они обычно более дорогие и требуют оптовый заказ. По этим причинам, мы решили использовать автоматизированную жидкого обработчик оснащенный штрих-кодов труб 2D. Хотя тAKES время настроить и влечет за собой первоначальные вложения для приобретения инструмента, в долгосрочной перспективе такие факторы будут компенсированы за счет увеличения производительности и воспроизводимости анализов. На самом деле, несколько групп ранее сообщалось успешной интеграции автоматизированной обработчика жидкого в их рабочий процесс иммунофенотипирования или аналогичных приложений 21,22. Автоматизированные решения для анализа потока цитометрии также доступны из коммерческих источников (FACS SPA III, Автоматизированная Коктейль Подготовка станции, а FlowStainer). Это дополнительно указывает есть большая потребность в автоматизированной приготовления коктейлей для иммунофенотипирования.
После освоения этой техники, мы предполагаем, что развитие полностью автоматизированной иммунофенотипирования цельной крови будет способствовать дальнейшему снижению эксперимент-к-эксперимента изменчивость и может сделать весь иммунофенотипирования крови осуществимо даже в заходящего 23 многоцентрового клинического исследования. Мы уже начали с помощью растворяющих былч помощник автоматизировать лизису и стиральные шаги. Мы также предусматривают, что автоматизированное определение объема антитела в 2D трубок штрихкода и отслеживание выдачи реагента позволит значительно улучшить инвентаризацию антител и контроль качества нашего метода, соответственно.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
Referencias
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O’Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
- BD biosciences. . Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
