사람 말초 혈액의 Immunophenotypic 분석에 대한 항체 칵테일을 준비하는 반 자동화 된 접근
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
흐름에 의한 말초 혈액의 면역 표현형은 세포 계측법 질병과 치료 기간 동안 주변 백혈구의 주파수 및 활성화 상태의 변화를 결정한다. 그것은 치료 효과를 예측하고 새로운 치료 표적을 식별 할 수있는 가능성이있다. 전체 혈액 얼룩은 시료 준비 중에 발생할 수있는 유물을 최소화 조작되지 혈액을 사용합니다. 그러나, 전혈 염색은 샘플의 무결성을 보장하기 위해 신선하게 수집 한 혈액에서 수행되어야한다. 또한,이 탠덤 염료의 잠재적 불안정성을 방지하고 선명한 보라색 염료 시약 사이의 상호 작용을 방지하기 위해 같은 날 항체 칵테일을 제조하는 것이 가장 좋다. 따라서, 전체 혈액 얼룩은 내 간 실험적인 변화를 통제하기 위해주의 표준화가 필요합니다.
여기서는 antibod 제조 표준 과정으로 2 차원 (2D) 바코드 리더를 구비 한 자동화 된 액체 핸들러 배포 신고유동 세포 계측법에 대한 Y 칵테일. 항체는 데이터베이스에서 컴파일 된 96 웰 형식 및 내용에 배치 2D 바코드 튜브에 옮겼다. 액체 핸들러는 데이터베이스 내 항체 이름을 참조하여 소스 항체 튜브를 찾을 수있다. 우리의 방법은, 소스 항체 튜브의 위치 조정을 위해 지루하고 제거. 또한 사용자가 용이하게 분석 용 소프트웨어 방법에서, 스크립트 재 기입하지 않고 데이터베이스 수정 등 용도 항체, 부피, 및 대상으로 항체 분배 프로세스 상세의 번호를 변경할 수 있도록 융통성을 제공 하였다.
개념 실험의 증거 분석 세포 계측법 11 색, 17 항체 흐름의 복제 준비에 의해 입증 뛰어난 인터 및 인트라 분석 정밀도를 달성했다. 이 방법론은 분석 유동 세포 계측법에 대한 전체 처리량이 증가하고 상세한 pheno에 필요한 복잡한 항체 칵테일을 매일 준비를 촉진갓 수집 된 항 응고 말초 혈액의 typic 특성.
Introduction
인간의 말초 혈액의 면역 표현형은 면역 세포 하위 집합 1 양적, 질적 변화를 결정한다. 이 작업 및 저항 예측 바이오 마커 에이즈 발견 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고, 복합 면역 요법의 개발을 용이하게한다. 따라서, 면역 표현형의 검증 및 표준화 학술 연구자, 임상 실험실과 산업에 상당한 관심의 영역입니다.
유세포 방법에 의해 말초 혈액의 면역 표현형 현재 혈액 학적 악성 종양 3 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염 4,5, 면역 요구에 대한 말초 혈액 신뢰성 면역 표현형 그 때문에 검증 및 표준화 할 사항의 임상 관리에 사용되지만 면역 세포 하위 집합 및 활성화 / 억제 수용체 1,6-8보다 광범위한 범위를 필요로한다. Successful 면역 표현형은 장비 설치 및 세포 얼룩 절차 9,10에 관한 실험 – 투 – 실험 변동성을 최소화하기 위해주의 표준화가 필요합니다. 유동 세포 계측법에 대한 장비 설정 표준화가 잘 전 우려 9,11,12를 해결하기 위해 설립 동안, 면역 세포의 서브 세트 및 활성화 상태의 범위를 제한하지 않고 세포의 염색에 관한 변동을 최소화하는 방법을 불분명.
항원의 수가 증가를 검출 할 때, 너무도 오차 변동은 최적의 시약 분주과 교차 오염에 기인 기회를한다. 응고 전혈 phenoptypic 분석 방법 임상 화학 분석에 사용하기 위해 1980 년대 후반에 설립되었다. 이 같은 방법은 샘플 준비를위한 연구 실험실의 요구를 제공하고 있습니다. 중요한 것은, 임상 실험에 사용 된 항체 칵테일은 통상적으로 덜 복잡하다 아바ilable 사전 역가 및 제조 업체에서 미리 혼합. 미리 혼합 된 항체 칵테일의 단 하나의 전송이 필요합니다. 연구 설정에서 10-16 항체의 항체 칵테일 전형적인. 각각의 칵테일 실험실에 의해 안정성을 검증하거나 각 분석하기 전에 신선한 준비해야합니다. 샘플에 대해 여러 항체 칵테일을 준비 50-80 개별 항체의 피펫, 지루하고 오류가 발생하기 쉬운 둘 다 작업을 수반 할 수 있습니다.
칵테일 제조의 자동화는 적은 오류와 같은 수동 칵테일 준비에 비해 여러 가지 장점을 가지고, 피펫의 정확도를 증가하고, 어쩌면 시약 소모 감소했다. 여기서는 제제를 샘플링 관련 변동성을 최소화하기 위해 면역 표현형의 세포 염색 방법으로 2 차원 (2D) 바코드 리더를 구비 한 자동화 된 액체 핸들러의 성공적인 도입을보고한다.
Protocol
수집 및이 프로토콜의 말초 혈액의 사용은 섭리의 건강 및 서비스 임상 시험 심사위원회의 승인을했다. 모든 사람을 대상으로 자신의 서면 동의서를 제공했다. 참고 : 범용주의 사항을 따르십시오. 모든 인간의 혈액은 감염 및 바이오 안전성 수준이 관행에 따라 처리하는 경우로서 취급 할 필요가 있습니다. 주 : 말초 전혈 면역 표현형은 적혈구를 제거하는 저장성 용해 하였다 세포 표면 항원을 검출하기 위해 형광 표지 된 모노클로 날 항체로 전혈 응고를 배양함으로써 수행된다. 세포를 세척하고 시료를 유동 세포 계측기에 의해 분석된다. 본원에 기재된 방법은, 2 차원 바코드 리더를 구비 한 자동화 액체 핸들러를 사용하여 항체 칵테일의 제조에 초점을 맞추고있다. 첫째, 면역 세포 하위 집합을 식별하는 "기본 칵테일"그리고 난을 모니터링하는 "정품 인증 칵테일"nducible 개별적 항원 (표 1)을 준비한다. 그런 다음 두 칵테일는 "마스터 항체 칵테일"을 만들기 위해 혼합된다. 워크 플로 그림 1을 참조하십시오. 1. 표본 실온에서 유지 한 다음, 나트륨 헤파린 항응고제 혈관의 정맥 천자를 통해 말초 혈액 수집 적절한 혼합을 보장하기 위해 부드럽게 수회 반전 및. 응고 또는 13 용혈 경우 시료를 거부합니다. 2. 연구소 용 준비 라벨 2D 바코드 사람이 읽을 수있는 레이블 튜브 (항체 이름, 벤더, 카탈로그 번호, 로트 번호). 2D 바코드 튜브를 대응 (표 1에 나열된) 벤더에서 항체 유리 병의 전체 내용을 전송합니다. 주 : 거짓 거품 시약의 최적 전송 결과 액체 레벨 감지 (LLS)을 트리거로 거품을 소개하지 않도록 특히주의하십시오. 참고 : 확인 각 항체 VI알은 실행에 대한 충분한 항체를 보유하고 있습니다. 2 차원 바코드 판독기에 의해 각각의 튜브에 대한 2 차원 바코드를 읽어보십시오. 스프레드 시트 소프트웨어를 사용하여 항체 이름 (AB) 및 바코드 읽기를 포함하는 스프레드 시트 (BC)을 확인하고 "AB_BC.csv"(표 2)와 같은 쉼표로 구분 된 값 (CSV) 파일을 저장합니다. 주 : (예 : 0163562544)의 경우 바코드 번호에 대한 최초의 "0"을 유지하기 위해 "텍스트"없습니다 "번호"로 세포를 포맷해야합니다. 데이터의 끝을 지정하는 데 마지막에 "X, 0000000000"를 추가합니다. 자동화 된 액체 투수의 갑판의 프레임에 나사 LLS 금속 플레이트 LLS를 활성화합니다. 자동 액체 처리기 3.는 프로그래밍 주 : "마스터 Antibo을위한"베이스 칵테일 "및 3.1"활성화 칵테일 ") 제조) 방법, 및 b)에있어서, 두 가지 방법이 자동화 액체 핸들러 소프트웨어로 프로그램 될자료 칵테일 "과"3.2 활성화 칵테일 ") (그림 1)"을 결합하여 "DY 칵테일. "기본 칵테일"과 "활성화 칵테일"(그림 2)의 제조 방법을 만듭니다. 테이블 : P50 팁 (BASE_CT_P50와 "자료 칵테일"에 대한 μL 항체 이름 (AB_NAME), 대상 튜브 위치 (WELL-BASE 또는 WELL-ACT) 및 볼륨 (VOL)에 대한 정보가 스프레드 시트를 만들 스프레드 시트 소프트웨어를 사용하여 3) P200 팁 (BASE_CT_P200 표 4)와 P50 팁 (ACT_CT_P50와 함께 "정품 인증 칵테일"표 5) 또는 P200 팁 (ACT_CT_P200 표 6). CSV 파일로 저장합니다. "잘-BASE"와 "잘-ACT"위치는 그림 3에서 번호를 참조하십시오. 참고 : VOL = 역가 X μL (염색 + 2 #)는. 표 1의 역가가 많이 다릅니다. 운영자는 가슴을 결정해야한다각 항체 어 다른 사람 (14)에 의해 설명 된 바와 같이. "자료 칵테일"과 "활성화 칵테일"을 만들기위한 방법을 만들기 위해 컴퓨터에 자동 액체 처리기 소프트웨어를 실행 아이콘을 클릭합니다. 참고 : 실험 실용을 정의합니다 3.1.3-3.1.7 다음 단계 : 2 차원 바코드 튜브 (그림 4)와 튜브 랙. 측정은 참고 자료로 제공됩니다. 연구자들은 결정하고 각 악기에 대한 조정해야합니다. "프로젝트"아래에있는 도구 모음에서 "연구소 용 유형 편집기"를 선택합니다. "복사"를 선택, 96 웰 평판에 대한 객체를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 팝업 창에 "Matrix_OneML_TubeRack"를 입력합니다. 대화 상자를 엽니 다 개체 "Matrix_OneML_TubeRack"을 두 번 클릭합니다. 강조 "기본 정보", 12.775 cm (X)와 "스팬"에 대한 8.546 cm (Y) 및 "높이"에 대한 4.625 cm을 설정합니다. (그림 4A). 다음으로, 하이라이트 "Movem엔트 정보 "그리퍼 센서를 사용합니다."설정 그리퍼 0 (X), 0 (Y), 0.3 (Z), 그리퍼 확인 후, 그리퍼 Unsqueeze 2.6 cm를 -0.1cm 꽉 제한 속도 75 %, 및 오프셋 "(그림 (b)). 그런 다음, "Well_1"를 강조 표시합니다. 설정은 다음과 같습니다 : "음 오프셋"; 1.5 cm (X) 및 1.13 cm (Y), "그럼 카운트"; 12 (X) 및 8 (Y), "음 간격"; 0.9 (X) 및 0.9 (Y), "최대 볼륨"; 1,500 μL, 형식 ", 정규,"오프셋 콜럼이 "0, 및"기본 볼륨 "0 (도 4C). 마지막으로, 키를 누릅니다 "잘 구성"(그림 4C)의 오른쪽에있는 "편집 …"버튼을 클릭합니다. 팝업 창에서 설정을 다음과 같이 "모양"; 라운드, "상위 반경"; 0.37 cm, "낮은 반경"; 0.37 cm, 및 "높이"; 3.9 cm. "아래 절"및 설정 "모양"을 확인; 콘, "반경"; 0.37 cm, 및 "높이"; 0.4 cm (그림 4D). 참고 : 미세 원심 분리 튜브와 튜브 랙 : 다음 단계는 3.1.8-3.1.11 실험 실용을 정의합니다. 측정은 참고 자료로 제공됩니다. 연구자들은 결정하고 각 악기에 대한 조정해야합니다. "프로젝트"아래에있는 도구 모음에서 "연구소 용 유형 편집기"를 선택합니다. "복사"입력 "SmallTuberack_microfugetubes"을 선택, 24 위치 랙 객체를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 대화 상자를 엽니 다 개체 "SmallTuberack_microfugetubes"을 두 번 클릭합니다. 강조 "기본 정보", 12.75 cm (X)와 "스팬"8.5 cm (Y) 및 "높이"에 대한 3.95 cm를 설정합니다. 다음, "Well_1"를 강조 표시합니다. 설정은 다음과 같습니다 : "음 오프셋"; 1.621 cm (X)와 1.181 cm (Y), "그럼 카운트"; 6 (X), 4 (Y), "음 간격"; 1.9 (X) 및 1.9 (Y), "최대 볼륨"; 1,000 μL, 형식 ", 정규,"오프셋 콜럼이 "0, 및"기본 볼륨 "0. 마지막으로, 키를 누릅니다"잘 구성"의 오른쪽에있는 "편집 …"버튼을 클릭합니다. 팝업 창에서 설정을 다음과 같이 "모양"; 라운드, "상위 반경"; 0.3345 cm, "낮은 반경"; 0.274 cm, 및 "높이"; 3.6728 cm. "아래 절"및 설정 "모양"을 확인; 반구 및 "반경"; 0.1575 cm. 참고 : 다음 단계는 3.1.12-3.1.35 "자료 칵테일"과 "활성화 칵테일"(그림 2)을 만들기위한 "새로운 방법"을 프로그래밍하는 방법을 설명합니다. "새로운 방법"아이콘을 클릭하고을 클릭합니다. 새로운 방법의 "시작"과 "마침"아이콘 (그림 2) 사이에 "IF"아이콘을 드래그합니다. 클릭하고 "IF"아이콘을 선택합니다. 조건에 대해 다음을 입력합니다. CreateObject를 ( "World.EngineObject")를 시뮬레이션 참고 :이 오류 검사를 수행하는 소프트웨어를 방지하고 작동이 방법을 사용합니다. 이 단계없이, (S)3.1.20에서 설명) : 바코드 단계 "바코드를 읽어 VisionMate"후에 만 사용할 수 있습니다 읽 oftware는 데이터 세트에 대한 누락 된 정보를 알려줍니다. 이 단계는 소프트웨어의 검증 단계를 불가능하게하기 때문에, 운영자는이 방법을 수행 할 수있는 갑판에 충분한 정보와 시약이 확인해야합니다. "IF"아이콘 (그림 2)에서 "다음"아이콘 최초의 "종료"아이콘 사이의 "장비 설정"아이콘을 삽입합니다. 참고 : 다음의 모든 단계는, "그렇지"아이콘 "IF"아이콘에서 두 번째 "종료"아이콘 사이의 드래그 아이콘 단계는 "그렇지"에 캡슐화되도록. 방법 "그렇지"아이콘 (그림 2) 아래에있는 "장비 설정"아이콘을 드래그합니다. 창을 열려면 방법 "장비 설정"아이콘을 클릭합니다. P50 LLS 여과 도움말 아이콘을 드래그하여 labwares를 구성, P200 LLS 여과 팁, P1000 팁, "Matrix_OneML_TubeRack"이 "SmallTuberack_microfugetubes"및 아이콘 목록에서 해당 갑판 위치에 저장. "AB_BOX"로 "Matrix_OneML_TubeRack"이름에 대한 대화 상자를 엽니 다. "SmallTuberack_microfugetubes"에 대한 대화 상자를 열고 자료 칵테일에 대해 "BASE_CT"및 활성화 칵테일에 대해 "ACT_CT"로 다른 (그림 5)와 같은 하나의 이름을 지정합니다. "자료 칵테일"과 "활성화 칵테일"에 대한의 microfuge 튜브에 저수지에서 버퍼를 전송하는 단계를 추가하는 방법 (그림 2)에 "전송"아이콘을 드래그합니다. 전송 볼륨 = 25 μL의 X "자료 칵테일"과 = 25 μL x에 대한 (+2 염색의 #) "정품 인증 칵테일"에 대한 (+2 염색의 #). 2 차원 바코드 판독기에 "Matrix_OneML_TubeRack"를 이동하는 단계를 추가합니다. (방법에 인터넷을 "VisionMate 이동"아이콘을 드래그gure 2) 갑판에 바코드 판독기 위치로 초기 갑판 위치에서 이동을 지정합니다. "VisionMate을 : 바코드 읽기"드래그하는 방법 (그림 2)에 아이콘을. 대화 상자를 열고 장치로 "VisionMate"를 선택하고 "BC_Read"로 데이터 세트의 이름을 지정합니다. , "사용자 일시 정지"(그림 2) 드래그하여 선택 "전체 시스템을 일시 중지하고이 메시지를 표시"모든 바코드가 다음 단계로 진행하기 전에 읽을 것을 확인의 사용자를 생각 나게하는 필드에 설명을 입력합니다. 참고 : 다음 단계는 3.1.22-3.1.26 바코드 정보를 이용하여 잘 위치 및 항체 이름 사이에 연결됩니다. 이는 항체 이름 "AB"에 기초하여 특정 항체의 위치를 찾기 위해 자동화 된 액체 핸들러를 사용한다. 방법 (그림 2)에 "보고 단계"아이콘을 드래그합니다. 텍스트 프로그램을 이용하여 텍스트 파일을 작성하고 저장할컴퓨터의 문서 폴더에 "BC_Readout"로. "단계를보고"에 대한 대화 상자를 열고 보고서 스타일에 대해 "텍스트 파일"을 선택하고 검색을 통해 "BC_Readout"파일을 선택합니다. 참고 : 바코드 정보 "Matrix_OneML_TubeRack"에 2 차원 바코드 튜브 잘 위치에 대한 읽기를 포함 3.1.16에 구성된 결과 "BC_Readout"파일이 조언을 제외하고 갑판에 모든 labwares에 대한 정보를 포함합니다. 바코드 잘 정보를 연결하는 "데이터 세트 만들기"단계를 추가합니다. 방법 "만들기 데이터 세트"아이콘을 드래그 (그림 2), "파일에서 읽기"를 선택하고 "AB_BC.csv"를 선택 대화 상자를 엽니을 클릭합니다 (2.4에서 만든 표 2), "쉼표를 확인 구분 "과"파일은 헤더 행을 "이 있습니다. 참고 : 파일 미리보기 창에서 항체 이름 (AB) 및 바코드 볼 수 있어야 (BC)를 읽습니다. 의에서3.1.25에서 "만들기 데이터 세트"에 대한 AME 대화 상자, 실험 실용 위치는 "VM1"을 선택하고 "0"스택 깊이, 선택 "샘플 ID를 일치", 그리고 필드 "BC"를 사용하여이 데이터와 일치하는 "BC_Read"를 설정합니다. "AB"와 "데이터가 생성 될 설정"를 "BC"(그림 6)를 선택합니다. 방법 (그림 2)에 "VisionMate 이동"아이콘을 드래그하여 다시 갑판에 초기 갑판의 위치에 바코드 리더 위치 "VM1"에서 움직임을 지정합니다. 참고 : 다음 단계는 3.1.28-3.1.33 "자료 칵테일"에 대한 전송 단계를 정의합니다. "작업리스트"아이콘 (그림 2) 드래그 3.1.1에서 만든 작업 목록 파일 "Base_CT_P50"(표 3)를 찾아 선택합니다. "루프 전체 작업리스트"를 확인합니다. "작업리스트"아이콘 바로 아래 "전송"아이콘을 드래그 (그림 2). </ 리> 사양 필드를 엽니 다 "전송"아이콘을 클릭합니다. 선택 "을 언로드", 프로브의 한, 조언, 여과 P50 LLS을 선택하고 전송을 수행하고, "전송 사이의 변경 팁"을 확인하는 경우. 클릭하여 소스를 추가 이름 "AB_BOX"에 의해 갑판에 실험 실용, 선택 위치로 "Matrix_OneML_TubeRack"를 선택 "소스를 추가하려면 여기를 클릭하십시오." "전송"에 대한 사양 필드에 "줌에서"마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 (96) 우물의 다이어그램에 즉시 "사용 데이터 세트"후 "AB"를 선택하고 값과 "= AB_NAME" "동일하다"위치를 선택 . 선택의 선택 전송 기술. 참고 : LLS의 사용은 매우 하단에 침전 된 이물질이 묻지 않게하는 것이 좋습니다. "전송"을 클릭하여 선택 대상에 대한 사양 필드에 "대상을 추가하려면 여기를 클릭하십시오", 권리 확대를 클릭하고 "SmallTuberack_를 선택microfugetubes "실험 실용으로, 같은 볼륨"BASE_CT "이름으로 갑판에, 위치"= VOL 텍스트로 선택을 지정합니다. "축소 한 후, 확인, 다시 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭" "하고"식으로 대상을 지정 아래 : 대상 갑판의 위치에 대한 변수로 "입력"= WELL_BASE ". 다음 P200 LLS 여과 팁에 대한 조언뿐만 아니라 적절한 피펫 기술을 여과 P200의 LLS를 선택 csv 파일 "Base_CT_P200"(표 4)를 선택하여, 유사 P200 팁 "자료 칵테일"에 대한 3.1.29-3.1.32를 반복합니다. 참고 : 다음 단계 3.1.34 및 3.1.35은 "정품 인증 칵테일"에 대한 전송 단계를 정의합니다. 대상으로 "ACT_CT"를 csv 파일 "ACT_CT_P50"(표 5)를 선택하고 선택하여, 유사 P50 팁 "활성화 칵테일"에 대한 3.1.29-3.1.32를 반복합니다. 마우스 오른쪽 단추로 대상을 클릭하고 "텍스트로 선택 지정";. 확인 "아래의 식으로 대상을 지정 :"입력 "= WELL_ACT을"대상 위치에 대한 변수로. csv 파일 "ACT_CT_P200"(표 6)과 P200 LLS 필터링 팁을 선택하여, 유사 P200 팁 "활성화 칵테일"에 대한 3.1.34를 반복합니다. 참고 : "기본 칵테일"과 "활성화 칵테일"을 만들기위한 방법은 저장 한 후 닫을 수 있습니다. 5 ㎖의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브 (그림 7)에 "기본 칵테일"과 "활성화 칵테일"을 결합하여 "마스터 항체 칵테일"을 만들기위한 새로운 방법을 만듭니다. 참고 : 5 ml의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브와 튜브 랙 : 다음 단계는 3.2.1-3.2.6 실험 실용을 정의합니다. 숫자는 참조 용으로 만 제공됩니다. 연구자들은 결정하고 악기 조정해야합니다. "프로젝트"아래에있는 도구 모음에서 "연구소 용 유형 편집기"를 선택합니다. 마우스 오른쪽 카스티24 위치 랙 객체에 ICK는 "복사"를 선택하고 팝업 창에서 "BiocisionCoolRack_XT"를 입력합니다. 대화 상자를 엽니 다 개체 "BiocisionCoolRack_XT"을 두 번 클릭합니다. 강조 "기본 정보", 12.78 cm (X)와 "스팬"에 대한 8.57 cm (Y) 및 "높이"에 대한 7.93 cm를 설정합니다. "Well_1"를 선택합니다. 설정은 다음과 같습니다 : "음 오프셋"; 1.55 cm (X) 및 1.33 cm (Y), "그럼 카운트"; 6 (X), 4 (Y), "음 간격"; 1.95 (X) 및 1.97 (Y), "최대 볼륨"; 2,000 μL, 형식 ", 정규,"오프셋 콜럼이 "0, 및"기본 볼륨 "0. 편집 "잘 구성"을 엽니 다. "모양"; 다음과 같이 설정 라운드, "상위 반경"; 0.5375 cm, "낮은 반경"; 0.48 cm, 및 "높이"; 7.07 cm. "아래 절"및 설정 "모양"을 확인; 반구 및 "반경"; 0.45 cm. 참고 : 다음 단계를3.2.6-3.2.7는 전송 단계를 정의하고 단계 3.2.14에서 사용할 수. 다음 헤더 항체 칵테일을 만들기위한 csv 파일 "AB_MACT"(표 7)를 작성하십시오) "SRC_BASE을"; "자료 칵테일", b)는 "WELL_BASE"에 대한 실험 실용 이름; "자료 칵테일", C) "VOL_BASE"에 대한 실험 실용 잘 위치; μL에서 "기본 칵테일", d)에 "SRC_ACT"에 대한 전송 볼륨; "정품 인증 칵테일", 전자) "WELL_ACT"에 대한 실험 실용 이름; "정품 인증 칵테일", f)는 "VOL_ACT"에 대한 실험 실용 잘 위치; μL에서 "활성화 칵테일", g) "DEST_MACT"에 대한 전송 볼륨; "마스터 항체 칵테일"및 H) "WELL_MACT"의 갑판 위치 정보; 또한 "마스터 항체 칵테일"에 대한 튜브 랙에 정보를 배치합니다. ) "BASE_CT"을 사용하여 다음과 같이 3.2.6에서 만든 헤더) (표 7)에서 정보를 입력도 3a에 도시 된 바와 같이, "WELL_BASE"에 대한 SRC_BASE에서, b)는리스트 아니라 위치 정보, C) 항체의 목록 전체 부피 ( "VOL_BASE"에서 하나의 염색에 대한 모든 기본 항체 역가)의 버퍼 + 합계 25 μL, d)에 사용 그림 3B, 항체의 F) 목록 전체 부피 ( "VOL_ACT"에서 하나의 염색에 대한 모든 활성 항체 역가)의 버퍼 + 합계 25 μL에서와 같이 "WELL_BASE"에 대한 SRC_ACT, 전자)리스트 아니라 위치 정보에서 "ACT_CT". 전송 T 셀 FM3에 대한 버퍼의 25 μL. 그림 8과 같이 "WELL_MACT"에 대한 "DEST_MACT"에 대한 "SPL_TUBES_1"(3.2.10 참조) 및 h)리스트 아니라 위치 정보를 사용하여 테스트 1-3, g)은 표 1을 참조하십시오. 참고 : 다음 단계 3.2.8-3.2.15 "마스터 항체 칵테일"을 만들기위한 방법을 프로그램 할 새로운 방법 (그림 7)를 엽니 다. "측량기를 드래그새로운 방법 ument 설정 "아이콘 (그림 7). 데크도 상에 "장비 설정"P1000의 팁, 드래그 아이콘, 두 개의 "SmallTuberack_microfugetubes"및 "BiocisionCoolRack_XT"의 지정 필드에. 3.1.17에 규정 된 각각 "BASE_CT"와 "ACT_CT"와 같은 두 개의 "SmallTuberack_microfugetubes"이름에 대한 대화 상자를 엽니 다. 3.2.7 (그림 9)에 규정 된 "SPL_TUBES_1"로 대화 "BiocisionCoolRack_XT"에 대한 상자와 이름을 엽니 다. 방법 (그림 7)에 "그룹"아이콘을 드래그하여 새로운 "그룹"을 추가합니다. "마스터 항체 칵테일"(그림 7)을 만들기위한 "기본 칵테일"을 전송하는 데 직접 "그룹"아이콘 아래에있는 "전송 파일에서"아이콘을 드래그합니다. "파일에서 전송"의 스펙 필드에서, s의 사용 P1000 팁을 선택차기 "를 언로드"전송이 완료하고 "전송 사이의 변경 팁"을 확인하는 경우. "파일에서 전송"의 스펙 필드에서, 검색하여 파일 "AB_MACT"(표 7)을 선택 확인 "파일은 헤더 행이". 소스 실험 실용 위치에 대해 "SRC_BASE"및 소스 실험 실용 잘 내용은 "WELL_BASE"를 선택, 대상 실험 실용은 "DEST_MACT"와 대상 실험 실용 잘 내용은 "WELL_MACT"를 선택하고 (볼륨 정보에 대한 그림을 "VOL_BASE"를 선택 (10)). P1000 팁에 대한 적절한 전송 방법을 선택했다. 참고 : LLS는이 과정에 필요하지 않을 수 있습니다. 직접 "마스터 항체 칵테일"을 만들기위한 "기본 칵테일"과 혼합되어야한다 "활성화 칵테일"을 전송하는 "그룹"아래로 드래그하여 다른 "에서 파일 전송"추가 (그림 7 </ STRONG>). 마찬가지로 3.2.13 및 3.2.14에서와 같이 전송 단계를 설정합니다. 다음과 같은 예외가 있습니다) 소스 실험 실용 잘 정보 소스 실험 실용 위치에 대해 "SRC_ACT", b)는 "WELL_ACT"을 선택하고 볼륨 정보 다) "VOL_ACT". 4. 운영 절차 첫째, 컴퓨터에 2D 바코드 리더를 실행하기 위해 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭합니다. 그런 다음 컴퓨터에 자동 액체 핸들러를 실행하기 위해 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭합니다. "악기"에서 자동 액체 핸들러의 주요 주사기에 "홈 축"을 선택합니다. 모든 주사기가 눈에 보이는 기포를 포함하지 있는지 확인합니다. 참고 : "홈 축"의 악기를 다음 움직임을 만드는에서 참조 점을 제공합니다. 에 대한 소프트웨어 (그림 2) "자료 칵테일"과 "활성화 칵테일"을 만들기위한 방법을 엽니 다utomated 액체 핸들러입니다. "BASE_CT"를 할 수있는 "자료 칵테일"과 "활성화 칵테일"의 수에 따라 "ACT_CT"에 대한 "SmallTuberack_microfugetubes"(그림 3)에의 microfuge 튜브를 놓습니다. 그런 다음 "기기 설정"(그림 5)에 따라 갑판에 배치합니다. "기기 설정"에 따라 갑판에 버퍼 탱크를 배치합니다. 드 캡 8 채널 스크류 캡 decapper를 사용하는 항체를 포함하는 2 차원 바코드 튜브. 교차 오염을 방지하기 위해 모자를 들고 트레이에 정확한 순서로 캡을 보관하십시오. "기기 설정"(그림 5)에 따라 갑판에 "Matrix_OneML_TubeRack"을 놓습니다. "기기 설정"(그림 5)에 따라 갑판에 배치 P50의 LLS 여과 팁, P200 LLS 필터링 팁 및 P1000 팁. 녹색 트리를 클릭하여 방법을 시작합니다각 모양의 시작 아이콘입니다. 팝업 창이 나타 바와 같이, 방법에 정의 된 갑판에있는 모든 항목이 "장비 설정"을 일치하는지 확인하십시오. 이 포드 및 / 또는 그리퍼 호감 수 있으므로, 갑판에 "기기 설정"에 나열되지 않은 물건을 올려 놓지 마십시오. 보도는 "확인"을 진행합니다. "Matrix_OneML_TubeRack는"2D 바코드 리더로 이동하고 바코드를 읽을 후, 다른 팝업 창이 모든 바코드를 읽을 여부를 묻습니다. "OK"를 눌러 진행 한 번 확인했다. 자동 액체 핸들러에 의해 전송이 완료되면, 8 채널 스크류 캡 decapper를 사용하여 2D 바코드 튜브를 요약하자면, 다시 4 ° C까지 넣어. 소용돌이 모두의 microfuge 튜브 적극적으로 20 초, 그리고 튜브 랙에를 반환합니다. 참고 : 부족 텍싱 세포의 최적 얼룩의 원인이 될 수 있습니다. "자료 칵테일"과 "활성화 칵테일"을 만들기위한 방법을 닫습니다. 그런 다음 "마스터 항체 칵테일"을 만들기위한 방법을 엽니 다. "BiocisionCoolRack_XT"(그림 8)에 사전 라벨 5 ml의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브를 설정하고 갑판에 놓습니다. 라벨은 "자료 칵테일"과 "활성화 칵테일는"뿐만 아니라 해당 환자 ID로 혼합 된 것을 표시해야합니다. 갑판에 "자료 칵테일", "정품 인증 칵테일"및 P1000 팁 (그림 9)에 대한 튜브 랙을 배치합니다. 방법 (그림 7)를 시작합니다. 팝업 창에서 메시지로, 확인 방법 갑판 경기 경음악 설정의 항목 (그림 9) 그. 보도는 "확인"을 진행합니다. 위의 과정이 완료되면, 수동 항체 칵테일을 포함하는 각 5 ml의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 혈액 표본의 50 μl를 추가합니다. 클래스 II 생물 안전 캐비닛 내부 소용돌이 샘플 튜브와 어둠 속에서 실온에서 15 분을 품어. 탁이 일관성이 얼룩 발생하므로 전자 케어, 튜브의 측면에 피를 질주 방지 할 수 있습니다. 조심스럽게 흐름 세척 버퍼 적신 면봉으로 혈액의 얼룩을 제거합니다. RBC의 용해 완충액 1 ㎖를 수동으로 추가하고 어둠 속에서 실온에서 15 분을 품어. 400 x g에서 5 분 동안 유동 세척 완충액 (0.1 % 소듐 아 지드, 1 % BSA, 1X HBSS 10 U / ㎖ 헤파린) 및 원심 2 ㎖를 추가한다. 클래스 II 생물 안전 캐비닛 내부 상층 액을 버린다. 이 세척 과정을 반복합니다. – 다시 일시 중지 흐름 세척 버퍼의 0.5 ml의 스테인드 세포를. 설정이 사이토 흐름은 밀가루 레이저 및 적절한 필터, 5 ml의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브를 사용하여 실행 표본을 갖추고있다. 데이터 수집 12,15 표준 세포 계측기 교정 및 형광 보상 방법을 사용합니다. 표 1에 "형광"에 나열된 모든 매개 변수를 수집합니다. 참고 : 적절한 제어 물질은 적절한 엉덩이를 보장하기 위해 각 실행에 사용되어야한다바깥 성능을 제공합니다. 실행중인 샘플 후, 수출은 FCS 파일로 데이터를 인수했다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 인간 면역학 프로젝트 (1)에 의해 설명 게이팅 전략을 사용하여 T 세포 하위 집합을 식별합니다.
Representative Results
전혈 면역 표현형의 목적은 정량적 (면역 세포 서브 세트들의 묘사) 면역 세포 질적 (활성화 상태 검출) 정보를 얻을 수있다. 우리는 소폭 방법 (표 1)의 전반적인 성능을 향상시키기 위해 인간 면역 프로젝트 (1)에 의해 제안 된 T 세포의 면역 표현형 패널을 수정했다. 우리 T 세포 패널 나이브 중앙 메모리 (CM), 이펙터 메모리 (EM) 및 이펙터 T 세포를 식별하는 것이다. 요약하면, 우리는 FCS-A 및 FCS-H에 기초하여 구별 이중선. 측면 분산 및 CD45 수준에 따라 림프구에 그리고 우리 문입니다. T 세포는 다음 CD3의 발현에 의해 식별됩니다. CD3 + T 세포의 γδ T 세포 αβ T 세포로 분화된다. αβ T 세포는 상기 CD4 +와 CD8 + T 세포로 나뉜다. CD4 + 및 CD8 + T 세포를 expressio에 기초하여 자신의 서브 세트에 대한 분석CD45RA 및 CCR7의 N : – CCR7 + CM, CD45RA + CCR7 + 나이브, CD45RA + CCR7 – CD45RA 이펙터 및 CD45RA – CCR7 – EM T 세포 (1). 또한, 우리는 또한 질적 인 정보를 얻기 위해 이러한 CD38, HLA-DR, ICOS, PD-1, GITR, 4-1BB, CD69, NKG2D 및 OX40 등의 활성화 마커의 발현을 모니터링 할 수 있습니다. 이 방법의 정밀도를 증명하기 위해 하루에 4 건강한 공여자로부터 5 회 주연 전혈 샘플을 염색. 11 게이트 림프구 및 편차 (%의 CV)의 퍼센트 계수의 퍼센트 T 세포 아 집단의 관계를 나타낸다. 문 림프구 각 부분 집합 %의 CV에 %의 T 세포 개체군의 상세한 분석은 시험 2에서 8. 데이터 테이블에 표시되고 3은 그림 11과 단순 표 8에 포함되지 않습니다. 25 % 이하 CV실행 (간 분석 정밀도) 사이에 연구 사용 10 표현형 바이오 마커 분석에 대한 허용 기준에 대한 제안되었다. 모든 측정은 ICOS + γδ T 세포 (26.64-46.39 %. 표 8)과 ICOS + CD8 T 세포 (14.64-58.39 %. 표 8)를 제외하고이 기준을 충족. 이 값은 데모 용으로 표시됩니다. ICOS는 주로 CD4 T 세포 (16)의 활성화에 중요한 역할을하기 때문에 우리는 이러한 측정치를 이용하지 않는다. 전체 인구에 대한 낮은 비율을 포함하는 집단에서 더 높은 %의 CV의 추세는 다른 사람 (7)에 의해 관찰되었다. 케이스 연구자들은 희귀 이벤트 모니터링 관련에서, 세포의 수는 더 큰 부정확성 (17)를 극복하기 위해 증가 될 필요를 조사 하였다. 함께, 우리의 데이터는 전체 혈액의 면역 표현형의 시료 전처리 자동화의 성공적인 구축을 보여줍니다. < IMG의 고도 = "그림 1"SRC = "/ 파일 / ftp_upload / 53485 / 53485fig1.jpg"/> 그림 주변 전체 혈액과 면역 표현형 1. 워크 플로우. immunophenotypic 분석의 단계 워크 플로 단계 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2. "자료 칵테일"과 "활성화 칵테일"을 만들기위한 방법의 개요. "자료 칵테일"및 자동화 액체 핸들러에 대한 소프트웨어의 "활성화 칵테일"을 만들기위한 방법의 단계가 표시됩니다. 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전. 전자 3 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 53485 / 53485fig3.jpg "/> BACE_CT 및 ACT_CT와 튜브 랙 그림 3. 레이아웃. (A)는 튜브 랙 "BACE_CT"에 대한 레이아웃을 보여줍니다. (B)는 튜브 랙 "ACT_CT"에 대한 레이아웃을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4. 2 차원 바코드 튜브와 튜브 랙 연구소 용 정의. 2 차원 바코드 튜브와 튜브 랙을 정의하는 단계 프로세스에 의해 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 485fig5.jpg "/> 그림 5. "자료 칵테일"과 "활성화 칵테일"을 만들기위한 방법 악기 설정이. 그것은 "자료 칵테일"과 "활성화 칵테일"을 만들기위한 방법에 대한 갑판의 레이아웃을 보여줍니다. 여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 그림. "데이터 세트 만들기"그림 6. 설치. 그것은 "만들기 데이터 세트"에 대한 세부 설정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. Figu "마스터 항체 칵테일"을 만들기위한 방법 7. 개요 재. 자동 액체 핸들러에 대한 소프트웨어의 "마스터 항체 칵테일"을 만들기위한 방법의 단계가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5 ml의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브와 튜브 랙 8. 레이아웃. 그것은 튜브 랙 "SPL_TUBES_1"에 대한 레이아웃을 보여줍니다. FM3 형광 마이너스 3 (화려한 보라색 (421), 피코 에리 트린, 및 알로)를 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. ftp_upload / 53485 / 53485fig9.jpg "/> 그림 9. "마스터 항체 칵테일"을 만들기위한 방법 악기 설정이. 그것은 "마스터 항체 칵테일"을 만들기위한 방법에 대한 갑판의 레이아웃을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. "파일에서 전송"10. 설치를 그림. 그것은 "에서 파일 전송"에 대한 세부 설정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 11. 낮은 VARI 반자동 전체 혈액의 면역 표현형의 능력. 사 건강한 기증자 분석 모든 세포 인구의 단일 CV 값은 파란색 개방 원으로 표시됩니다. 회귀 곡선은 청색 라인에 도시되어있다. 레드 라인은 95 % 확신 밴드와 탐욕 점선은 95 % 예측 밴드를 표시 표시 점선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 12 차선 염색. 염색 예 "BACE_CT"및 "ACT_CT"의 미세 원심 분리 튜브의 적절한 또는 불충분 텍싱하여 수행 하였다. B 두 개의 문이 인구가 있습니다. 약한 CD45 염색과 작은 인구는 최적의 염색을하지 않는 세포를 나타냅니다.g12large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그룹 채점자 형광 복제 역가 (μL / 염색) BASE 칵테일 TCELL CD45 FITC 2D1 0.4 CD3 Alexa700 UCHT1 1 CD8 APC-H7 SK1 0.4 CD4 를 PerCP-CY5.5 SK3 (2) CCR7 PE-CF594 150503 1 CD45RA PE-Cy7 L48 1 TCRab BV786 </TD> T10B9.1A-31 1 TCRgd BV650 B1 (5) 활성화 칵테일 1 TEST1 HLA-DR BV421 G46-6 (5) CD278 (ICOS) PE DX29 (5) CD38 APC HB7 1 정품 인증 칵테일 (2) TEST2 CD279 (PD1) BV421 EH12.1 2.5 CD357 (GITR) PE eBioAITR (5) CD137 (41BB) APC 4B4-1 (10) 활성화 칵테일 3 TEST3 CD69 BV421 FN50 1 </TD> CD314 (NKG2D) PE 1D11 (2) CD134 (OX40) APC ACT35 (5) 표 1에 변경된 T 세포 패널 항체 목록. AB 기원전 CD45_FITC 0,163,562,388 CD3_Alexa700 0,163,562,110 CD4_PerCP_CY5.5 0,163,562,364 CD8_APC-H7 0,163,562,363 CCR7_PE-CF594 0,163,562,387 CD45RA_PE-Cy7 0,163,562,091 TCRab_BV786 0,163,562,069 TCRgd_BV650 0,163,562,108 <td> A_HLA-DR_BV421 0,163,562,339 A_CD278 (ICOS) _PE 0,163,562,082 A_CD38_APC 0,163,562,317 A_CD279 (PD1) _BV421 0,163,562,340 A_CD357 (GITR) _PE 0,163,562,093 A_CD137 (41BB) _APC 0,163,562,315 A_CD69_BV421 0,163,562,341 A_CD314 (NKG2D) _PE 0,163,562,314 A_CD134 (OX40) _APC 0,163,562,316 2D 바코드 번호 표 2. 항체 이름. 그룹 WELL_BASE AB_NAME VOL TCELL 1 <td> CD8_APC-H7 7.2 TCELL 1 CD45_FITC 7.2 TCELL 1 CD3_Alexa700 (18) TCELL 1 CCR7_PE-CF594 (18) TCELL 1 CD45RA_PE-Cy7 (18) TCELL 1 TCRab_BV786 (18) 표 3. 파일 "BASE_CT_P50"항체 이름 및 볼륨 정보를 제공합니다. 그룹 WELL_BASE AB_NAME VOL TCELL </td> 1 CD4_PerCP_CY5.5 (36) TCELL 1 TCRgd_BV650 (90) 표 4. 파일 "BASE_CT_P200"항체 이름 및 볼륨 정보를 제공합니다. 그룹 WELL_ACT AB_NAME VOL TEST1 (7) A_HLA-DR_BV421 (30) TEST1 (7) A_CD278 (ICOS) _PE (30) TEST1 (7) A_CD38_APC 6 TEST2 (13) A_CD279 (PD1) _BV421 1(5) TEST2 (13) A_CD357 (GITR) _PE (30) TEST3 (19) A_CD314 (NKG2D) _PE (12) TEST3 (19) A_CD69_BV421 6 TEST3 (19) A_CD134 (OX40) _APC (30) 표 5. 파일 "ACT_ CT_P50"항체 이름 및 볼륨 정보를 제공합니다. 그룹 WELL_ACT AB_NAME VOL TEST2 (13) A_CD137 (41BB) _APC (60) 표 6. 파일 "ACT_CT _P200"항체 이름 및 볼륨 정보를 제공합니다. 기증자# SRC_ 베이스 BASE 칵테일 잘_ 베이스 VOL_ 베이스 SRC_ACT 시동한다 VATION 칵테일 잘_ 행위 VOL_ACT DEST_MACT 잘_ MACT HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 (25) SPL_TUBES_1 </tD> 1 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 (7) (36) SPL_TUBES_1 (7) HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 (13) 42.5 SPL_TUBES_1 (13) HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 (19) (33) SPL_TUBES_1 (19) HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 (25) SPL_TUBES_1 (2) HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 <td> ACT_CT TEST1 (7) (36) SPL_TUBES_1 8 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 (13) 42.5 SPL_TUBES_1 (14) HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 (19) (33) SPL_TUBES_1 (20) HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 (25) SPL_TUBES_1 삼 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 (7) (36) SPL_TUBES_1 9 <tr> HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 (13) 42.5 SPL_TUBES_1 (15) HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 (19) (33) SPL_TUBES_1 (21) HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 (25) SPL_TUBES_1 4 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 (7) (36) SPL_TUBES_1 (10) HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 </tD> (13) 42.5 SPL_TUBES_1 (16) HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 (19) (33) SPL_TUBES_1 (22) 표 7. 파일 "AB_MACT": "마스터 항체 칵테일"에 대한 소스 및 대상 정보를 제공합니다. 도 인구 #. 1 나는 II III IV V 인구 이름 CD3 + AB T 세포 GD T 세포 CD3 + CD4 + CD3 + CD8 + 림프구의 % </TD> Heathly 기증자 # 1 79.80 75.20 2.70 49.60 22.30 Heathly 도너 2 69.40 61.90 5.85 44.40 16.20 Heathly 도너 3 75.80 69.60 4.75 42.00 23.50 Heathly 도너 # 4 77.20 73.50 1.98 52.70 18.90 %이력서 Heathly 기증자 # 1 1.42 1.58 3.70 2.50 1.56 Heathly 도너 2 2.48 2.39 5.74 2.82 2.41 Heathly 도너 3 1.15 1.40 6.32 1.42 2.72 Heathly 도너 # 4 0.81 0.94 5.45 1.20 1.44 평균 1.47 1.58 5.30 1.99 2.03 표준 편차 0.72 0.61 1.13 0.79 0.63 시험 2 및 3에 대한 데이터는 데이터 표현을 단순화하기 위해도 5 및 표 8에 도시되지 않은 것이도 4 참고 플롯 각 서브 세트에 대한 림프구와 % CV %의 표 8. 원시 데이터.
Discussion
말초 혈액의 면역 표현형은 면역 개별 응답에 대한 통찰력을 확보하기위한 매우 중요합니다. 문제는 실험 – 투 – 실험 변동성 1,14을 제어하는 분석의 표준화에있다. 변화 중 하나는 주요 소스 샘플의 인간의 조작에있다. 따라서, 시료 처리의 부분 또는 전체 자동화 실험 간 실험 가변성 1,14 극적인 감소를 용이하게 생각할 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 전체 혈액의 면역 표현형의 샘플 염색에 대한 2 차원 바코드 판독기가 장착 된 자동화 액체 핸들러를 도입하여 분석 변동성을 최소화하기 위해 성공적인 노력을보고한다.
디자인, 우리의 방법은 다양합니다 그들을 정의하는 추가 "자료 칵테일"을 추가하여 다른 면역 하위 집합을 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 서브 세트들은 T 헬퍼 세포, T 조절 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포 및 단핵구 (원고를 포함준비) 18. 우리는 추가 마커 1을 도입하여 컨소시엄의 추천 항체 패널을 채택. 우리가 유도 항원의 검출에 대한 이러한 채널을 예약하고 싶었다로 세포 집단은, 검출기 화려한 보라색 421 (BV421)에 최소한의 방출과 형광 색소에 접합 된 "자료 칵테일", 피코 에리 트린 (PE)를 사용하여 식별 및 알로 (APC) 하였다. 이 기능은 면역 세포의 활성화 상태를 모니터링 할 수있는 가장 높은 감도를 보장뿐만 아니라,이 세 가지 형광 색소가 가장 많이 유도 마커에 대한 항체가 결합 될 때 새로운 활성화 마커를 유연하게 숙박 할 수 있습니다뿐만 아닙니다. 따라서, 우리의 방법뿐만 아니라 전체 혈액의 면역 표현형을위한 칵테일 제조에 적합뿐만 아니라 세분화 된 조직 (예를 들면, 종양)에서 발견 한 말초 혈액 단핵 세포와 세포를 포함하는 다른 샘플을 염색하는 데 유용합니다.
성공적인 소개우리의 방법의 duction 특별한 실험 실용 준비의 단계에 대한 관심, 그리고 프로그래밍 및 방법의 실행을 필요로한다. 2 차원 바코드 튜브의 제조는 사람이 읽을 수있는 라벨과 지정된 튜브에 항체의 전송과 라벨을 포함한다. 오류의 도입을 방지하기 위해, 우리는 두 사람과이 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 스프레드 시트를 변경 할 때마다, 연구자들은이 방법이 제대로 작동하는지 확인해야합니다. 프로그래밍시 적절한 피펫 팅 방법을 선택하는 것은 성공적인 액체 전송을 보장합니다. LLS는 우리가 P50 또는 P200 전도성 팁을 사용하는 항체 튜브의 바닥에서 침전 된 이물질을받지 않고 피펫 팅을 할 수 있습니다. LLS는 P1000 팁 더 민감하고 때로는 거짓 거품의 존재에 의해 트리거로 LLS는 P1000 팁에 대한 좋은 선택지가되지 않을 수 있습니다. 팁의 가장자리 사이의 공간이 충분하지 않으면 실험 실용 정의의 높이는, 예를 들면, 같은 차선의 액체 전사가 발생할 수있는 각 기기 조정되어야튜브의 바닥. 도 12에 도시 된 바와 같이 "기본 칵테일"및 / 또는 "활성화 칵테일"을 잘 볼 텍싱되지 않은 경우, 그것은 최적의 얼룩을 초래할 수있다.
우리는 시약 (19) 분배와 관련 변동성을 줄이기 위해 다른 방법으로 세포 염색을 위해 동결 건조 된 시약을 사용하는 방법에 대해 생각했다. 그러나, 브릴리언트 바이올렛 염료 고분자 접합체 서로 일으키는 비특이적 신호와 상호 작용하는 것으로 알려져있다. 이와 같이, 동결 건조 된 시약에 두 개 이상의 중합체 접합체 (예 BV421 및 BV650 등) 비 특정 시그널링이 발생할 수 첨가 (예 BV421 + 인구 BV650 배경 신호의 증가) 20. 또한, 동결 건조 된 시약은 새로운 염색 등의 유연성이 부족하다. 그들은 일반적으로 더 비싸고 대량 주문이 필요합니다. 이러한 이유로, 2 차원 바코드 튜브 장착 자동화 액체 핸들러를 사용하여 선택 하였다. 그것은 톤 있지만AKE를 시간을 설정하고 이러한 요인은 생산성 향상과 분석의 재현성에 의해 보상됩니다 장기적으로 악기를 구입하기 위해 선행 투자를 수반합니다. 사실, 몇몇 그룹은 이전에 면역 표현형 또는 유사한 애플리케이션 (21, 22)의 워크 플로우에 자동화 액체 핸들러의 성공적인 통합을보고했다. 유동 세포 계측법 분석을위한 자동화 솔루션은 상용 소스 (FACS SPA III, 자동 칵테일 제조 워크 스테이션 및 FlowStainer)에서 사용할 수 있습니다. 이것은 또한 면역 표현형에 대한 자동화 된 칵테일 준비를위한 큰 필요가 있음을 나타냅니다.
이 기술을 마스터 한 후, 우리는 완전 자동화 된 전체 혈액의 면역 표현형의 개발은 더 실험 – 투 – 실험 변동성을 줄일 수, 심지어 23을 설정 다기관 임상 시험에서 전체 혈액의 면역 표현형이 가능 할 수 있다는 구상. 우리는 이미를 Lyse이었다 사용하기 시작했다시간 조수 용해 및 세척 단계를 자동화합니다. 또한 2D 바코드 튜브 항체의 양과 시약 분배 추적 자동 판정 크게 각각 항체의 재고 및 우리의 방법을 통해 품질 관리를 향상시킬 수 있음을 상상할.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
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Citar este artículo
Koguchi, Y., Gonzalez, I. L., Meeuwsen, T. L., Miller, W. L., Haley, D. P., Tanibata-Branham, A. N., Bahjat, K. S. A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (108), e53485, doi:10.3791/53485 (2016).