Une approche semi-automatique pour la préparation des anticorps Cocktails pour immunophénotypique Analyse de sang périphérique humain
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
Immunophénotypage de sang périphérique par cytométrie de flux détermine des changements dans la fréquence et l'activation des leucocytes périphériques état pendant la maladie et le traitement. Il a le potentiel de prédire l'efficacité thérapeutique et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Toute coloration du sang utilise sang non manipulée, ce qui minimise les artefacts qui peuvent se produire lors de la préparation de l'échantillon. Cependant, la coloration du sang total doit également être effectuée sur le sang fraîchement prélevé afin d'assurer l'intégrité de l'échantillon. En outre, il est préférable de préparer des cocktails d'anticorps sur le même jour pour éviter l'instabilité potentielle de TanDEM-colorants et d'empêcher l'interaction de réactif entre les colorants violets brillants. Par conséquent, la coloration de sang total nécessite normalisation soin de contrôler la variabilité intra et inter-expérimentale.
Ici, nous rapportons le déploiement d'un manipulateur de liquide automatisé équipé d'un à deux dimensions (2D) lecteur de codes barres dans un processus standard de fabrication Antibodcocktails y pour la cytométrie de flux. Des anticorps ont été transférés dans des tubes à code-barres 2D disposés dans un format à 96 puits et leur contenu compilées dans une base de données. Le manipulateur de liquide pourrait alors localiser les flacons d'anticorps source en faisant référence à des noms d'anticorps au sein de la base de données. Notre méthode éliminé coordination fastidieuse pour le positionnement des tubes d'anticorps source. Il a fourni une polyvalence permettant à l'utilisateur de changer facilement un certain nombre de détails dans le processus de distribution d'anticorps comme un anticorps spécifique à utiliser, le volume et la destination en modifiant la base de données sans avoir à réécrire le script de la méthode logicielle pour chaque test.
Une preuve de concept expérience réalisée exceptionnelle précision de dosage inter et intra, démontrée par la préparation d'une réplique 11 couleurs, l'écoulement de 17 anticorps essai de cytométrie. Ces méthodes ont augmenté le débit global de cytométrie en flux des essais et de faciliter la préparation quotidienne des cocktails d'anticorps complexes nécessaires pour le phéno détailléecaractérisation typic du sang périphérique anticoagulé fraîchement prélevé.
Introduction
Immunophénotypage de sang périphérique humain détermine changements quantitatifs et qualitatifs dans des sous-ensembles de cellules immunitaires 1. Il permet de mieux comprendre les mécanismes d'action et de résistance, aides découverte de biomarqueurs prédictifs, et facilite le développement d'immunothérapies combinés. Par conséquent, la validation et la normalisation des immunophénotypage est une zone de grand intérêt pour les chercheurs universitaires, des laboratoires cliniques, et les industries.
Bien immunophénotypage du sang périphérique par des méthodes de cytométrie en flux est actuellement utilisé pour la gestion clinique des hémopathies malignes 2,3 et le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) 4,5, immunophénotypage fiable de sang périphérique pour les demandes d'immunothérapie des considérations spécifiques à la validation et la normalisation, car il exige une couverture plus étendue sur des sous-ensembles de cellules immunitaires et l'activation / récepteurs inhibiteurs 1,6-8. succeimmunophénotypage ssful nécessite normalisation soin de minimiser la variabilité expérience à l'expérience liée à la configuration de l'instrument et la coloration des cellules procédure 9,10. Si la normalisation des paramètres de l'appareil pour la cytométrie en flux est bien établie pour traiter l'ancienne préoccupation 9,11,12, on ne sait pas comment minimiser la variabilité liée à la coloration des cellules, sans restreindre la couverture de sous-ensembles de cellules immunitaires et de leur état d'activation.
Comme le nombre d'antigènes à détecter augmente, il en va de la possibilité d'erreur et la variabilité en raison des sous-optimale distribution de réactif et la contamination croisée. Méthodes d'analyse phenoptypic de sang total anticoagulé ont été établis à la fin des années 1980 pour une utilisation dans des essais de laboratoire clinique. Ces mêmes méthodes servent les besoins du laboratoire de recherche pour la préparation des échantillons. Surtout, les cocktails d'anticorps utilisés dans les laboratoires cliniques sont généralement moins complexe et avapré-titré ilable et pré-mélangée chez le fabricant. Un seul transfert du cocktail d'anticorps pré-mélangé est nécessaire. Dans le cadre de la recherche, des cocktails d'anticorps de 10-16 anticorps sont typiques. Chaque cocktail doit être validée pour la stabilité par le laboratoire ou fraîchement préparé avant chaque essai. Préparer plusieurs cocktails d'anticorps pour un échantillon pourrait entraîner le pipetage de 50-80 anticorps individuels, une tâche qui est à la fois fastidieux et source d'erreurs.
L'automatisation de la préparation du cocktail a plusieurs avantages par rapport à la préparation manuelle des cocktails tels que le moins d'erreurs, une plus grande précision de pipetage, et peut-être même diminué le gaspillage réactif. Nous rapportons ici l'introduction réussie d'un manipulateur de liquide automatisé équipé d'un à deux dimensions (2D) lecteur de code barre dans le processus cellulaire coloration des immunophénotypage pour minimiser la variabilité liée à la préparation des échantillons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunophénotypage du sang périphérique est d'une importance cruciale pour gagner un aperçu des réponses individuelles à l'immunothérapie. Le défi réside dans la normalisation d'épreuves pour contrôler expérience à expérience variabilité 1,14. Une source principale de la variabilité réside dans la manipulation humaine des échantillons. Par conséquent, il est concevable que l'automatisation partielle ou totale du traitement de l'échantillon de faciliter une réduction spectaculaire dans l'expérience à 1,14 variabilité expérience. Dans ce protocole, nous rapportons notre effort réussi à minimiser la variabilité essai en introduisant un manipulateur de liquide automatisé équipé 2D lecteur de code à barres pour l'échantillon coloration dans immunophénotypage de sang total.
Dans la conception, notre méthode est polyvalent et peut surveiller d'autres sous-ensembles immunitaires en ajoutant supplémentaires "Cocktails base" pour les définir. De tels sous-ensembles comprennent des cellules T auxiliaires, des cellules T régulatrices, les cellules B, les cellules NK, les cellules dendritiques et les monocytes (manuscrit enpréparation) 18. Nous avons adapté panneaux anticorps recommandées par le consortium en introduisant des marqueurs supplémentaires 1. populations cellulaires ont été identifiés à l'aide "Cocktail de base" conjugué à fluorochromes avec une émission minimale dans la violette brillant 421 (BV421), la phycoérythrine (PE), et l'allophycocyanine (APC) détecteurs, car nous voulions réserver ces canaux pour la détection d'antigènes inductibles. Cette caractéristique assure non seulement la sensibilité la plus élevée pour surveiller l'état d'activation des cellules immunitaires, mais permet également le logement souple des nouveaux marqueurs d'activation étant donné que ces trois fluorochromes sont le plus souvent conjugués avec des anticorps contre des marqueurs inductibles. Par conséquent, notre procédé est non seulement approprié pour la préparation de cocktail pour l'immunophénotypage de sang entier, mais est également utile pour la coloration d'autres échantillons y compris les cellules et les cellules mononucléaires du sang périphérique à partir de tissus récupérés ventilées (par exemple, une tumeur).
introduction réussieproduction de notre méthode nécessite une attention particulière aux étapes dans la préparation de matériel de laboratoire, et de la programmation et de l'exécution de la méthode. Préparation des tubes de codes à barres 2D comprend l'étiquetage avec des étiquettes lisibles et le transfert des anticorps aux tubes désignés. Pour éviter l'introduction d'erreurs, nous vous recommandons de le faire avec deux personnes. Chaque fois que la modification des feuilles de calcul, les enquêteurs doivent vérifier si la méthode fonctionne correctement. Le choix des méthodes de pipetage appropriées au cours de la programmation assure un transfert de liquide succès. LLS permet pipetage sans obtenir débris précipité du fond de tubes d'anticorps, pour lesquels nous utilisons soit P50 ou P200 pointes conductrices. LLS peuvent ne pas être une bonne option pour obtenir des conseils de P1000 comme LLS est plus sensible aux pointes de P1000 et parfois déclenché faussement par la présence de bulles. Heights dans la définition de matériel de laboratoire doivent être ajustés pour chaque instrument de transfert de liquide comme sous-optimale pourrait se produire, par exemple, s'il n'y a pas assez d'espace entre le bord de conseilset le fond de tubes. Comme le montre la Figure 12, si le «cocktail de base" et / ou "cocktail d'activation" ne sont pas bien au vortex, il peut en résulter une coloration optimale.
Nous avons pensé à l'aide de réactifs lyophilisés pour la coloration de la cellule comme une approche alternative pour réduire la variabilité liée avec le réactif de distribution 19. Cependant, les conjugués de polymère de colorants violets brillants sont connus pour interagir les uns avec les autres signaux non spécifiques provoquant. En tant que tel, en ajoutant plus de deux conjugués polymères (par exemple, BV421 et BV650 etc.) dans les réactifs lyophilisés peuvent provoquer la signalisation non spécifique (par exemple, augmentation du signal de BV650 de fond dans BV421 + population) 20. En outre, les réactifs lyophilisés manquent de souplesse pour inclure une nouvelle coloration. Ils sont généralement plus coûteux et nécessitent une commande groupée. Pour ces raisons, nous avons choisi d'utiliser le gestionnaire de liquide automatisé équipé avec les tubes de codes à barres 2D. Bien qu'il tflocons de temps pour mettre en place et implique un investissement initial d'acheter l'instrument, dans le long terme, ces facteurs seront compensées par l'augmentation de la productivité et la reproductibilité des tests. En fait, quelques groupes précédemment rapporté l'intégration réussie du gestionnaire de liquide automatisé dans leur flux de travail d'immunophénotypage ou applications similaires 21,22. solutions automatisées pour l'analyse de cytométrie en flux sont également disponibles auprès de sources commerciales (FACS SPA III, Cocktail Préparation automatique de postes de travail, et FlowStainer). Cela indique en outre il y a un grand besoin pour la préparation de cocktail automatisé pour immunophénotypage.
Après la maîtrise de cette technique, nous envisageons que le développement de l'immunophénotypage entièrement automatisé de sang total permettra de réduire davantage la variabilité expérience à l'expérience et pourrait faire immunophénotypage de sang total possible même dans un cadre 23 étude clinique multicentrique. Nous avons déjà commencé à utiliser une lyse étaith assistant pour automatiser la lyse et des étapes de lavage. Nous envisageons également que la détermination automatique de la quantité d'anticorps dans les tubes de codes à barres 2D et le suivi de réactif distribution permettra d'améliorer grandement l'inventaire d'anticorps et le contrôle de qualité sur notre méthode, respectivement.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
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