半自动化的方法准备抗体鸡尾酒人外周血中免疫表型分析
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
外周血通过流式细胞免疫仪确定疾病和治疗过程中外周血白细胞的频率和激活状态的改变。它具有预测治疗功效，并确定新的治疗目标的潜力。全血染色使用未经处理的血液，最大限度地减少可样品制备过程中可能出现的文物。然而，全血染色还必须在新鲜采集的血液进行，以确保样品的完整性。此外，最好是在同一天准备抗体的鸡尾酒，以避免串联染料的潜在不稳定性，防止灿烂的紫色染料之间试剂反应。因此，全血染色需要仔细标准化来控制内和实验间的差异。
这里，我们报告装有的二维（2D）条形码读取器的自动液体处理器的调配成使得antibod的标准方法Ÿ鸡尾酒流式细胞仪。抗体被转移到设置在数据库中编译一个96孔格式及其内容的二维条形码的管中。然后，液体处理器可以通过在数据库中引用抗体名称查找源抗体的小瓶。我们的方法消除了繁琐的协调源抗体管的定位。它提供的多功能性允许用户容易地通过修改的数据库，而不在每个测定中软件的方法重写脚本更改任何数目的抗体分配工艺细节，如特异性抗体的使用，体积，和目的地。
概念实验的证明取得了突出的间和分子内精密度，由一个11色，17 – 抗体流式细胞仪检测的重复编写证明。这些方法增加的总吞吐量，流式细胞仪检测，并协助每天准备的详细苯氧所需的复杂抗体鸡尾酒新鲜收集抗凝外周血typic表征。
Introduction
的人末梢血免疫确定在免疫细胞亚群1的定量和定性的改变。它提供了洞察和行动性，预测性的生物标志物的发现艾滋病的机制，并促进联合免疫疗法的发展。因此，免疫的验证和标准化是相当感兴趣的学术研究人员，临床实验室，和工业的领域。
虽然外周血通过流式细胞方法免疫目前用于血液恶性肿瘤2,3和人类免疫缺陷病毒（HIV）感染4,5，免疫治疗需求的外周血可靠免疫在验证和标准化，因为它具体考虑的临床管理要求对免疫细胞亚群和激活/抑制性受体1,6-8覆盖范围更加广泛。帅客ssful免疫需要仔细标准化，以减少相关的仪器设置和细胞染色过程9,10实验对实验的可变性。虽然流式细胞仪的仪器设置标准化是公认的解决前者关注9,11,12，它如何在不限制免疫细胞亚群和他们的激活状态的覆盖范围最小化与细胞染色变化仍不清楚。
作为待检测的抗原的数目的增加，所以也没有用于误差和变异由于不理想的试剂分注和交叉污染的机会。成立于80年代末用于临床实验室检测为使用抗凝全血phenoptypic分析方法。这些相同的方法服务于科研实验室样品制备的需求。重要的是，在临床实验室中使用的抗体的鸡尾酒通常较不复杂和AVAilable预滴定和从制造商预混合。仅需要预混合抗体混合物的单个传输。在研究设置，10-16抗体的抗体鸡尾酒是典型的。每个鸡尾酒必须通过实验室验证的稳定性或制备的每个实验前新鲜。准备多种抗体鸡尾酒的样本可能带来50-80个人抗体的移液，既繁琐又容易出错的任务。
鸡尾酒制剂的自动化拥有手动鸡尾酒制剂几个优点，例如更少的错误，提高了移液的准确度，甚至可能降低试剂的浪费。这里，我们报告成功引入装有的二维（2D）条形码读取器到免疫的细胞染色过程中尽量减少样品制备相关的变异的自动液体处理器的。
Protocol
收集和使用的外周血该协议被批准为Providence医疗卫生及服务机构审查委员会。所有的人类受试者提供书面知情同意书。 注意：按照通用的注意事项。所有的人体血液，应视为犹如传染病，并按照生物安全等级2的做法处理。 注意：与外围全血免疫分是由温育抗凝全血用荧光标记的单克隆抗体来检测细胞表面抗原，随后低渗裂解去除红血细胞进行的。洗涤细胞并将样品通过流式细胞仪进行分析。本文所描述的方法主要针对制备使用配备有2D条形码阅读器的自动液体处理器抗体鸡尾酒。首先，“基地鸡尾酒”标识免疫细胞亚群和“激活鸡尾酒”监视我nducible抗原单独制备（见表1）。那么这两个鸡尾酒混合，创造出“大师抗体混合物”。 参见图1的工作流程。 1.标本通过在一个肝素钠抗凝血液收集管静脉穿刺收集外周血，反转轻轻几次，以确保适当的混合，然后保持在室温。如果凝块或溶血13拒绝标本。 2.医学实验准备标签二维条码管与人类可读标签（抗体名称，厂商，目录号和批号）。 传送从厂商（ 如表1所列）抗体的小瓶的全部内容，以相应的二维条形码的管。 注：请特别小心不要引入气泡产生气泡错误地触发液位传感（LLS）导致试剂的次优传输。 注：确保每个抗体VI人有运行足够的抗体。 阅读二维条码为每管二维条码阅读器。 请使用电子表格软件，其中包括抗体名称（AB）和条码读取电子表格（BC），它分隔值（CSV）文件保存在一个逗号作为“AB_BC.csv”（ 表2）。 注意：确保格式化细胞作为“文本”而不是“数”，以保持第一个“0”的条形码数字，如果任何（例如，0163562544）。添加“×，0000000000”末来指定数据结束。 螺钉LLS金属板于甲板中的自动化液体处理程序的帧，以使LLS。 3.编程为自动液体处理器注意：两种方法将在软件的自动液体处理器进行编程：a）对于制备“基础鸡尾酒”，并在3.1“激活鸡尾酒”）的方法，和b）的方法用于制备“主AntiboDY鸡尾酒“通过组合”基础鸡尾酒“和”3.2激活鸡尾酒“）（ 图1）。 创建用于使“基础鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”（图2）的方法。 使用电子表格软件，使该具有用于微升抗体名称（AB_NAME），目的地管位置（WELL-BASE或WELL-ACT）和音量（VOL）的“基地鸡尾酒”与P50的提示（BASE_CT_P50信息的电子表格：表3）或 P200提示（BASE_CT_P200： 表4）和“激活鸡尾酒”与P50提示（ACT_CT_P50： 表5）或P200提示（ACT_CT_P200： 表6）。将其保存为CSV文件。对于“WELL-基地”和“WELL-ACT”位置，请参阅数字在图3中。 注：VOL =效价点¯x微升（染色+ 2＃）。 表 1滴度很多具体。操作者应确定一个针锋相对如由他人14描述每个抗体呃。 点击图标来启动该软件为自动化液体处理器在电脑上制作“基地鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”创建一个方法。 注：以下步骤3.1.3-3.1.7将定义实验室器具：管机架二维条码管（ 图4）。测量被提供作为参考。调查应确定和调整每个仪器。 在“项目”下的工具栏中选择“医学实验类型编辑器”。在对象上右键单击一个96孔平板中，选择“复制”，在弹出的窗口中输入“Matrix_OneML_TubeRack”。 对象“Matrix_OneML_TubeRack”双击打开对话框。选中“基本信息”，设置12.775厘米（X）和8.546厘米（Y）的“跨越”和4.625厘米的“高度”。 （图4A）。 其次，突出“MOVEM耳鼻喉信息“。设置爪偏移0（X），0（Y）和0.3（Z），手爪挤压-0.1cm，爪Unsqueeze2.6厘米，限速75％，然后勾选”使用夹钳传感器“（图4B）。 然后，突出“Well_1”。设置方法如下：“好吧偏移”; 1.5厘米（X）和1.13厘米（Y），“好伯爵”; 12（X）和8（Y）“，井网”; 0.9（X）和0.9（Y），“最大容量”; 1500微升，格式“;定期，”偏移科拉姆2“0，”默认卷“; 0（图4C）。 最后，按一个“编辑”按钮，以“好配置”（图4C）的权利。在弹出的窗口中，设置如下：“形状”;圆“上半径”; 0.37厘米，“下半径”; 0.37厘米，和“高度”; 3.9厘米。检查“底部”，并设置“形状”;锥，“半径”; 0.37厘米，和“高度”; 0.4厘米（图4D）。注：以下步骤3.1.8-3.1.11将定义实验室器具：管机架离心管。测量被提供作为参考。调查应确定和调整每个仪器。 在“项目”下的工具栏中选择“医学实验类型编辑器”。在对象上右键单击一个24位机架，选择“复制”，然后键入“SmallTuberack_microfugetubes”。 在对象“SmallTuberack_microfugetubes”双击打开对话框。选中“基本信息”，设置12.75厘米（X）和8.5厘米（Y）的“跨度”3.95厘米“高度”。 其次，突出“Well_1”。设置方法如下：“好吧偏移”; 1.621厘米（X）和1.181厘米（Y），“好伯爵”; 6（X）和4（Y）“，井网”; 1.9（X）和1.9（Y），“最大容量”; 1000微升，格式“;定期，”偏移科拉姆2“0，”默认卷“; 0。 最后，按一个“编辑”按钮，以“好配置”的权利。在弹出的窗口中，设置如下：“形状”;圆“上半径”; 0.3345厘米，“下半径”; 0.274厘米和“高度”; 3.6728厘米。检查“底部”，并设置“形状”;半球，并且“半径”; 0.1575厘米。 注：以下步骤3.1.12-3.1.35将解释如何为使得“基地鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”（图2）程序的“新方法”。 点击“新方法”图标，并打开。 将一个“开始”和“完成”的新方法（图2）图标之间的“IF”图标。点击并突出“IF”图标。键入以下的条件：的CreateObject（“World.EngineObject”）模拟注意：这将防止软件进行错误检查并启用此方法的工作。没有这一步骤，在S3.1.20中描述）：条形码读取只步骤“读取条形码VisionMate”后可用oftware会提醒缺少的信息数据集。因为此步骤禁用软件验证步骤，操作人员必须确认有足够的提示和试剂在甲板上，以执行此方法。 将“然后”图标，第一个“结束”图标之间的“仪器设置”图标下的“IF”图标（ 如图2）。 注意：以下所有步骤，这样的步骤都封装在“其他”图标，并在“IF”图标，第二个“结束”图标之间的拖动图标中的“其他”。 在拖动的方法（ 图2）中的“其他”图标下方的“仪器设置”图标。 单击方法的“仪器设置”图标，打开窗口。通过拖动的P50 LLS过滤提示图标配置labwares，P200 LLS过滤提示，P1000提示，“Matrix_OneML_TubeRack”，两个“SmallTuberack_microfugetubes”，而水库从图标列表对应的甲板位置。 打开对话框的“Matrix_OneML_TubeRack”和名为“AB_BOX”。打开对话框的“SmallTuberack_microfugetubes”并命名一个作为“BASE_CT”为基本鸡尾酒，另一个为“ACT_CT”进行激活鸡尾酒（图5）。 一个“传送”图标拖到方法（图2），增加了对从水库传输缓冲区中的离心管为“基地鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”的一个步骤。传输量= 25微升x对于“基地鸡尾酒”和= 25微升X（+2染色的＃）为“激活鸡尾酒”（染色+2＃）。 添加步骤移动“Matrix_OneML_TubeRack”到二维条码阅读器。一个“VisionMate移动”图标拖到方法（ 网络连接古尔2），并指定由最初的甲板位置到甲板上的条形码阅读器的位置移动。 拖动“VisionMate：读取条形码”图标的方法（图2）。打开对话框，选择“VisionMate”作为设备并命名数据设置为“BC_Read”。 拖动“用户暂停”（如图2），选择“暂停整个系统，并显示此消息”并键入注释到现场提醒确认所有条码都在进行下一步之前阅读的用户。 注：以下步骤3.1.22-3.1.26将使用条形码的信息以及位置和抗体名之间联系起来。这将使自动液体处理器找到基于抗体名“AB”的特定抗体的一个位置。 一个“报告步骤”图标拖到方法（图2）。 使用文本程序创建一个文本文件并将其保存作为在计算机上的文件夹“BC_Readout”。 打开对话框的“报告步骤”，选择“文本文件”的报告样式，并选择通过浏览了“BC_Readout”文件。 注：由此产生的“BC_Readout”文件将包含的信息，除了提示，在甲板上所有labwares中配置的3.1.16包括条形码信息读取二维条码管及井位，在“Matrix_OneML_TubeRack”。 添加“创建数据集”的步骤链接条形码和良好的信息。 “创建数据集”图标拖到方法（如图2），单击它打开对话框，选择“从文件中读取”，然后选择“AB_BC.csv”（2.4中创建的表2），选中“逗号带分隔符“和”文件有标题行“。 注意：在文件预览窗口，抗体名称（AB）和条码读取（BC）应该被看到。 在S在3.1.25为“创建数据集”AME对话框中，选择“VM1”为实验室器具的位置和“0”的栈深度，选择“匹配样品标识”，并使用领域的“BC”，以配合数据设置“BC_Read”。选择“AB”和“BC”的“数据集要创建”（图6）。 一个“VisionMate移动”图标拖到方法（ 图2），并指定从条形码阅读器位置“VM1”回迁到甲板上的初始位置的甲板。 注：以下步骤3.1.28-3.1.33将确定“基地鸡尾酒”转移一步。 将一个“工作表”图标（ 如图2所示），浏览并选择在3.1.1创建工作列表文件“Base_CT_P50”（表3）。选中“循环整个工作表”。 直接拖动“传送”图标的“工作表”图标的下方（ 图2）。</ LI> 点击“传送”图标，打开指定字段。只选择探针之一，P50 LLS过滤提示，选择“卸载它们”当传输完成后，检查“传输之间切换提示”。通过单击添加源“点击此处添加源”，选择“Matrix_OneML_TubeRack”作为实验室器具，并选择位置在甲板上的名字“AB_BOX”。 在“传输”规范场，“放大”通过右键单击该图的96口井，然后选择“AB”之后立即“使用数据集”并选择它的价值“等于”和“= AB_NAME” 。选择的选择转移技术。 注：强烈建议LLS使用，以避免让杂物沉淀底部附近。 在“传送”，通过点击选择目的地的规范场“点击此处添加一个目的地”，右键点击可放大并选择“SmallTuberack_microfugetubes“作为实验器具，容积为”= VOL“，和位置的名字在甲板上”BASE_CT“缩小后，再次单击鼠标右键，选中”指定选择为文本“，并选中”指定用表达式目标如下：“并输入”= WELL_BASE“作为目的地甲板位置的变量。 重复同样3.1.29-3.1.32为“基地鸡尾酒”与P200的提示，通过选择CSV文件“Base_CT_P200”（表4），然后选择过滤技巧以及适当的吸管技术P200 LLS过滤提示P200 LLS。 注：以下步骤3.1.34和3.1.35将确定“激活鸡尾酒”转移一步。 重复同样3.1.29-3.1.32为“激活鸡尾酒”与P50的提示，通过选择CSV文件“ACT_CT_P50”（表5），选择“ACT_CT”作为目标。右键单击目标，并检查“指定选择为文本”;。选择“指定与下面的表达式的目标：”并输入“= WELL_ACT”作为目标位置的变量。 重复同样3.1.34为“激活鸡尾酒”与P200的提示，通过选择CSV文件“ACT_CT_P200”（表6）和P200 LLS过滤提示。 注：为使“基地鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”的方法可以保存后关闭。 通过组合“基础鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”到5毫升圆底聚苯乙烯试管（图7）创建用于制作“主抗体鸡尾酒”的新方法。 注意：下面的步骤3.2.1-3.2.6将定义实验室器具：该管架用5ml圆底聚苯乙烯试管中。提供了用于参考号码。调查应确定和调整仪器。 在“项目”下的工具栏中选择“医学实验类型编辑器”。右键CL对于24位机架的对象上ICK，选择“复制”，并在弹出的窗口中输入“BiocisionCoolRack_XT”。 对象“BiocisionCoolRack_XT”双击打开对话框。 选中“基本信息”，设置12.78厘米（X）和8.57厘米（Y）的“跨越”和7.93厘米的“高度”。 突出“Well_1”。设置方法如下：“好吧偏移”; 1.55厘米（X）和1.33厘米（Y），“好伯爵”; 6（X）和4（Y）“，井网”; 1.95（X）和1.97（Y），“最大容量”; 2000微升，格式“;定期，”偏移科拉姆2“0，”默认卷“; 0。 打开“嗯配置”进行编辑。设置方法如下：“形状”;圆“上半径”; 0.5375厘米，“下半径”; 0.48厘米，和“高度”; 7.07厘米。检查“底部”，并设置“形状”;半球，并且“半径”; 0.45厘米。 注意：下面的步骤3.2.6-3.2.7将定义转移步骤，并在步骤3.2.14使用。 用于制备抗体的鸡尾酒具有以下标题创建CSV文件“AB_MACT”（表7）：一）“SRC_BASE”对于“基地鸡尾酒”，二）“WELL_BASE”一个实验室器具名称;以及在实验室器具的位置为“基地鸡尾酒”，C）“VOL_BASE”在微升“基地鸡尾酒”，D）“SRC_ACT”传输量;对于“激活鸡尾酒”，E）“WELL_ACT”一个实验室器具名称;以及在实验室器具的位置为“激活鸡尾酒”，F）“VOL_ACT”在微升“激活鸡尾酒”，七）“DEST_MACT”传输量;对于“主抗体鸡尾酒”，和h）“WELL_MACT”甲板位置信息;以及定位在管架的“主抗体鸡尾酒”的信息。 填写以下）3.2.6创建标题（ 表7）信息如下：a）使用“BASE_CT”下SRC_BASE; b）为“WELL_BASE”作为如图 3A所示列表以及位置信息，三）的抗体的名单总体积（25微升“VOL_BASE”下的所有基地抗体滴度为单一染色）的缓冲液+总和，d）利用“ACT_CT”下SRC_ACT，电子）列表以及位置信息，如图3B中，f）名单的抗体的总体积（25微升“VOL_ACT”下的所有激活的抗体滴度为单一染色）的缓冲液+总和所示的“WELL_BASE”。转移25微升缓冲液中对T细胞FM3。 参照表1对试验1-3，G）用“SPL_TUBES_1”（见3.2.10）为“DEST_MACT”，以及h）列表以及位置信息“WELL_MACT”作为如图 8所示。 注：以下步骤3.2.8-3.2.15将制作“主抗体鸡尾酒”编程方法打开一个新的方法（图7）。 拖动“INSTR输稿设置“图标，新方法（图7）。 在“仪器设置”，拖动图标P1000的提示，两个“SmallTuberack_microfugetubes”和“BiocisionCoolRack_XT”在甲板上图的规范领域。打开对话框为两个“SmallTuberack_microfugetubes”和名称为“BASE_CT”和“ACT_CT”，分别作为在3.1.17指定。打开“BiocisionCoolRack_XT”对话框和名称作为3.2.7（图9）指定的“SPL_TUBES_1”。 通过拖动“本集团”图标的方法（图7）添加一个新的“集团”。 拖动“从文件传送”图标正下方的“组”图标，传递“基地鸡尾酒”制作“大师抗体鸡尾酒”（图7）。 在“传输来自文件”规范场，在使用选择P1000的提示，S选“卸载它们”当传输完成后，检查“传输之间切换提示”。 在“传输来自文件”规范字段中，选择通过浏览文件“AB_MACT”（表7），勾选“文件有标题行”。选择源实验器具的位置“SRC_BASE”和“WELL_BASE”在源实验室器具以及信息，选择目的地实验室器具“DEST_MACT”和“WELL_MACT”在目的地实验室器具以及信息，并选择“VOL_BASE”卷信息（图10）。选择了P1000的提示适当转让技术。 注意：LLS可能不适用于这个过程是必要的。 通过拖动它的正下方“本集团”转移“激活鸡尾酒”，也就是与“基地鸡尾酒”混合制作“大师抗体鸡尾酒”添加其他“传送来自文件”（如图7 </ STRONG>）。同样设置了转移步骤为3.2.13和3.2.14。例外情况如下：a）选择在源实验器具以及信息“SRC_ACT”源实验器具的位置，二）“WELL_ACT”，以及c）“VOL_ACT”卷信息。 4.操作步骤首先，双击软件图标启动二维条码读取器在计算机上。 然后，双击软件图标来启动计算机上的自动化液体处理程序。 在“仪器”，选择“本地所有轴”，以自动液体处理器的主要注射器。确保所有注射器不含可见气泡。 注：“首页所有轴”也将给仪器从中进行后续动作的参照点。 打开用于使“基础鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”的方法中的软件（图2）的一个utomated液体处理器。 的离心管放置到“SmallTuberack_microfugetubes”为“BASE_CT”，并根据“基础鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”来进行数字“ACT_CT”（图3）。然后按照“仪器设置”（图5）将它们放置在甲板上。 据“仪器设置”将带有缓冲储存在甲板上。 德盖采用8通道螺帽启盖器含有抗体的二维条码管。保持帽的确切顺序盖帽拿着托盘，以避免交叉污染。据“仪器设置”（图5）将“Matrix_OneML_TubeRack”甲板上。 根据“仪器设置”（如图5）将 P50 LLS过滤提示，P200 LLS过滤提示和技巧P1000在甲板上。 点击绿色三启动方法角形启动图标。根据提示在弹出的窗口中，确保在甲板上的所有项目匹配“仪器设置”中定义的方法。不要将未在甲板上的“仪器设置”中列出的任何对象，因为这可能会挤压吊舱和/或夹子。按“确定”继续。 在“Matrix_OneML_TubeRack”被移动到二维条码阅读器后和条形码阅读，另一个弹出窗口，要求所有的条形码是否被读取。按“OK”继续一旦确认。 经自动化液体处理程序转让完成后，回顾一下用一个8声道的螺丝帽启盖器二维条码管，并把他们带回4℃。 涡旋所有离心管剧烈持续20秒，然后将它们返回到管架。 注意：涡旋不足可能导致细胞的次优的染色。 关闭制法“基地鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”。然后打开制作“大师抗体鸡尾酒”方法。 设置预标记5毫升圆底聚苯乙烯试管的“BiocisionCoolRack_XT”（图8），并将其放置在甲板上。标签应标明什么是“基地鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”混合，以及适当的患者ID。 放置管架为“基础鸡尾酒”，“激活鸡尾酒”，和P1000提示在甲板上（图9）。启动方法（图7）。根据提示在弹出的窗口中，确保在该方法甲板器乐比赛设置项（图9）。按“确定”继续。 当上述过程完成时，手动添加50微升血液标本成每次5毫升的圆底聚苯乙烯试管包含抗体混合物。 II类生物安全柜内涡流样品管并在黑暗中孵育15分钟，在室温。德È小心，以避免在管子的侧面条纹血，因为这将导致不一致的染色。小心地用流动洗涤液浸湿的棉签去除血液任何条纹。 手动加入1 ml的RBC裂解缓冲液并在黑暗中孵育在室温15分钟。 加2ml流洗涤缓冲液（0.1％叠氮化钠，1％BSA，10U / ml的肝素于1×HBSS）和离心机在400×g下5分钟。弃上清II级生物安全柜中。重复此洗涤过程。重新悬浮在0.5ml流洗涤缓冲液染色的细胞。 设置流式细胞仪，一个流配备面粉激光器和适当的过滤器，并用5毫升的圆底聚苯乙烯试管运行标本。用于数据采集标准12,15校准仪和荧光补偿的方法。收集表 1中的“荧光”中列出的所有参数。 注意：适当控制材料应在每次运行中使用，以确保正确的屁股AY性能。 运行样品后，出口获得的数据作为FCS文件。 使用适当的软件分析数据。使用确定由人类免疫学项目 1提出了一个设门T细胞亚群。
Representative Results
全血免疫的目标是获得定量的（免疫细胞亚群的划分）和免疫细胞的定性（激活状态检测）的信息。我们稍微修改由人类免疫学项目 1提出了改善我们的方法（ 表1）整体性能的T细胞免疫面板。我们的T细胞面板旨在确定天真，中央内存（CM），效应记忆（EM）和效应T细胞。简单地说，我们歧视的基础上FCS-A和FCS-H双峰。然后我们门基于侧散射和CD45水平淋巴细胞。 T细胞，然后通过CD3的表达鉴定。 CD3 + T细胞分化为γδT细胞和αβT细胞。 αβT细胞被进一步分成CD4 +和CD8 + T细胞。然后CD4 +和CD8 + T细胞分析它们的子集基于expressioCD45RA和CCR7的N： – CCR7 + CM，CD45RA + CCR7 +幼稚，CD45RA + CCR7 – CD45RA效应，和CD45RA – CCR7 – EM T细胞1。此外，我们还监测其活化标记如CD38，HLA-DR，ICOS，PD-1，GITR，4-1BB，CD69，NKG2D，和OX40的表达获得的定性信息。 为了证明该方法的精确度，我们在一天染色周的全血样品来自4健康供体的5倍。 图11示出了门控淋巴细胞和方差（％CV）的百分比系数百分比的T细胞亚群之间的关系。关于门控的淋巴细胞，并为每个子集的％CV％的T细胞亚群的细目表从试验2所示8，数据和3中不包括在图11中为简单起见表8。小于25％的CV运行（批间精确度）之间已建议为表型生物标志物检测研究用10验收标准。所有的测量满足此条件的除ICOS +γδT细胞（26.64-46.39％。 表8）和ICOS + CD8 T细胞（14.64-58.39％。 表8）。这些值显示用于演示目的。我们并不利用这些测量，因为ICOS主要起到在CD4 + T细胞16的活化中起重要作用。被别人观察到的7％提高简历在包含了总人口比例较低的人群的趋势。在案件调查感兴趣的监测罕见事件，细胞的数目检查需求，以克服更大不精确17增加。总之，我们的数据显示，自动化的全血免疫的样品制备成功部署。 < IMG ALT =“图1”SRC =“/文件/ ftp_upload / 53485 / 53485fig1.jpg”/> 图1.工作流与周围全血免疫。通过免疫测定步工作流程步骤所示。 请点击此处查看该图的放大版本。 图2.制作“基地鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”方法概述。步骤制作“基地鸡尾酒”，并在软件自动液体处理器“激活鸡尾酒”方法所示。 请点击这里查看一个更大的版本这个数字。 E 3“SRC =”/文件/ ftp_upload / 53485 / 53485fig3.jpg“/> 图3.布局的管架与BACE_CT和ACT_CT。（A） 示出了管架“BACE_CT”的布局。 （B）显示了管架“ACT_CT”的布局。 请点击此处查看该图的放大版本。 图4. 医学实验定义为管架与二维条码管，通过定义管架与二维条码管的步骤步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。 485fig5.jpg“/> 图5. 仪器设置为使“基地鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”方法。它显示了用于制作“基地鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”方法甲板布局。 请点击此处查看这个大版本数字。 图6.“创建数据集”安装程序。它显示了“创建数据集”详细设置。 请点击此处查看该图的放大版本。 Figu再7.概述制作“大师抗体鸡尾酒”方法。如图中的步骤在软件自动液体处理器使得“康师傅抗体鸡尾酒”方法。 请点击此处查看该图的放大版本。 图8. 布局的管架用5ml圆底聚苯乙烯试管中。它显示为管架“SPL_TUBES_1”的布局。 FM3意味着荧光零下3（明亮的紫罗兰色421，藻红素，和别）。 请点击此处查看该图的放大版本。 ftp_upload / 53485 / 53485fig9.jpg“/> 图9. 仪器设置为使“主抗体鸡尾酒”方法。它显示了用于制作“大师抗体鸡尾酒”方法甲板布局。 请点击此处查看该图的放大版本。 图10. 设置为“传输来自文件”，它显示了“传送来自文件”详细设置。 请点击此处查看该图的放大版本。 图11.低瓦里在半自动化的全血免疫的能力。从四个健康供分析的所有细胞群体的单CV值被示为蓝色空心圆。回归曲线如图蓝线。红色虚线表示95％的信心乐队和贪婪虚线表示95％的预测波段。 请点击此处查看该图的放大版本。 图12.次优的染色。染色的一个实例 ，用从“BACE_CT”和“ACT_CT”离心管的充分或不充分涡旋进行。有在B两门的人群。弱CD45染色的人口较少表示没有得到最佳的染色细胞。g12large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。 组 MARKER 荧光 克隆 效价（微升/染色） BASE COCKTAIL TCELL CD45 FITC 2D1 0.4 CD3 Alexa700 UCHT1 1 CD8 APC-H7 SK1 0.4 CD4 PerCP-CY5.5 SK3 2 CCR7 PE-CF594 150503 1 CD45RA PE-Cy7的 L48 1 TCRab BV786 </TD> T10B9.1A-31 1 TCRgd BV650 B1 五 激活鸡尾酒1 TEST1 HLA-DR BV421 G46-6 五 CD278（ICOS） PE DX29 五 CD38 APC HB7 1 激活鸡尾酒2 TEST2 CD279（PD1） BV421 EH12.1 2.5 CD357（GITR） PE eBioAITR 五 CD137（41BB） APC 4B4-1 10 激活鸡尾酒3 TEST3 CD69 BV421 FN50 1 </TD> CD314（NKG2D） PE 1D11 2 CD134（OX40） APC ACT35 五 表1. 抗体列表修饰T细胞面板。 AB 公元前 CD45_FITC 0163562388 CD3_Alexa700 0163562110 CD4_PerCP_CY5.5 0163562364 CD8_APC-H7 0163562363 CCR7_PE-CF594 0163562387 CD45RA_PE-Cy7的 0163562091 TCRab_BV786 0163562069 TCRgd_BV650 0163562108 <td> A_HLA-DR_BV421 0163562339 A_CD278（ICOS）_PE 0163562082 A_CD38_APC 0163562317 A_CD279（PD1）_BV421 0163562340 A_CD357（GITR）_PE 0163562093 A_CD137（41BB）_APC 0163562315 A_CD69_BV421 0163562341 A_CD314（NKG2D）_PE 0163562314 A_CD134（OX40）_APC 0163562316 表2.抗体名以二维条码编号。 组 WELL_BASE AB_NAME VOL TCELL 1 <td> CD8_APC-H7 7.2 TCELL 1 CD45_FITC 7.2 TCELL 1 CD3_Alexa700 18 TCELL 1 CCR7_PE-CF594 18 TCELL 1 CD45RA_PE-Cy7的 18 TCELL 1 TCRab_BV786 18 表3. 文件“BASE_CT_P50”：抗体名称和数量信息。 组 WELL_BASE AB_NAME VOL TCELL </td> 1 CD4_PerCP_CY5.5 36 TCELL 1 TCRgd_BV650 90 表4. 文件“BASE_CT_P200”：抗体名称和数量信息。 组 WELL_ACT AB_NAME VOL TEST1 7 A_HLA-DR_BV421 三十 TEST1 7 A_CD278（ICOS）_PE 三十 TEST1 7 A_CD38_APC 6 TEST2 13 A_CD279（PD1）_BV421 1五 TEST2 13 A_CD357（GITR）_PE 三十 TEST3 19 A_CD314（NKG2D）_PE 12 TEST3 19 A_CD69_BV421 6 TEST3 19 A_CD134（OX40）_APC 三十 表5. 文件“ACT_ CT_P50”：抗体名称和数量信息。 组 WELL_ACT AB_NAME VOL TEST2 13 A_CD137（41BB）_APC 60 表6. 文件“ACT_CT _P200”：抗体名称和数量信息。 捐赠者＃ SRC_ 基础 BASE COCKTAIL 井_ 基础 VOL_ 基础 SRC_ACT 爱科特 VATION 鸡尾酒 井_ 法案 VOL_ACT DEST_MACT 井_ MACT HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 </tD> 1 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 7 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 13 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 19 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 2 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 <td> ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 8 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 14 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 20 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 3 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 9 <tr> HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 15 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 21 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 4 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 10 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 </tD> 13 42.5 SPL_TUBES_1 16 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 22 表7. 文件“AB_MACT”：源 和目的地信息为“主抗体混合物”。 人口＃图。 1 一世二 III 四， v 人口名字 CD3 + AB T细胞 GD T细胞 CD3 + CD4 + CD3 + CD8 + 淋巴细胞％</TD> Heathly供体＃1 79.80 75.20 2.70 49.60 22.30 Heathly供体＃2 69.40 61.90 5.85 44.40 16.20 Heathly供体＃3 75.80 69.60 4.75 42.00 23.50 Heathly供体＃4 77.20 73.50 1.98 52.70 18.90 ％简历 Heathly供体＃1 1.42 1.58 3.70 2.50 1.56 Heathly供体＃2 2.48 2.39 5.74 2.82 2.41 Heathly供体＃3 1.15 1.40 6.32 1.42 2.72 Heathly供体＃4 0.81 0.94 5.45 1.20 1.44 平均 1.47 1.58 5.30 1.99 2.03 标准差 0.72 0.61 1.13 0.79 0.63 表8.在图4中说明作图淋巴细胞和％CV对于每个子集的百分比的原始数据 ，对试验2和3的数据未在图5和表 8所示 ，以简化的数据呈现。
Discussion
外周血免疫是获得分析上市个别响应的免疫治疗至关重要。挑战在于标准化检测控制实验对实验变异1,14。变异性的一个主要来源在于样品的人的操纵。因此，可以想到，样本处理的部分或全部自动化将促进实验对实验变异性-1,14-显着减少。在这个协议中，我们报道了成功的努力通过导入装有二维条码阅读器，用于在全血免疫样品染色的自动化液体处理器，以尽量减少测定变异性。
在设计中，我们的方法是通用的，可以通过添加额外的“基地鸡尾酒”来定义他们监视其他免疫子集。这样的子集包括T辅助细胞，调节性T细胞，B细胞，NK细胞，树突细胞，和单核细胞（手稿中准备）18。我们通过引入额外的1标记适应财团的建议抗体面板。细胞群用“基地鸡尾酒”共轭荧光染料以最小排放到明亮的紫罗兰色421（BV421），藻红蛋白（PE）标识，别藻蓝蛋白（APC）的探测器，因为我们想保留这些渠道的检测诱导抗原。此功能不仅保证了最高灵敏度监测免疫细胞的激活状态，但也使我们在这三个荧光最常与抗诱导标志物的抗体结合的新的激活标记灵活的住宿。因此，我们的方法不仅适用于全血免疫鸡尾酒制剂，但也用于染色其它样品，包括从分列组织（例如，肿瘤）中回收外周血单核细胞和细胞是有用的。
成功的前奏我们的方法元币种需要实验室器皿准备特别注意步骤，编程和该方法的执行。二维条码管制备包括具有人可读的标签和抗体的转移到指定的管标签。为了防止错误的引入，我们建议两个人这样做。只要更改了电子表格，调查人员应验证该方法是否正常。编程过程中选择合适的移液的方法，确保成功的液体转移。 LLS使移液未经抗体管，为此，我们请使用P50或P200导电尖端的底部得到沉淀杂物。 LLS可能不是P1000提示一个不错的选择为LLS是P1000的提示更敏感，有时错误地气泡存在触发。在实验室器具定义的高度应为每个仪器可能发生作为次优的液体传输来调整，例如，如果没有提示的边缘之间有足够的空间和管子的底部。 如图 12所示，如果“基地鸡尾酒”和/或“激活鸡尾酒”都没有很好涡旋，它可能会导致次优的染色。
我们想过用冻干试剂细胞染色作为一种替代方法，以减少与试剂分装19相关的变异。然而，灿烂紫色染料的聚合物缀合物是已知的相互引起的非特异性信号进行交互。这样，加在冻干试剂两个以上聚合物缀合物（例如，BV421和BV650 等）可能会引起非特异性的信号（例如，在BV421 +群体 BV650背景信号增加）20。此外，冻干试剂缺乏包括新染色的灵活性。他们通常比较昂贵，并且需要大量订购。由于这些原因，我们选择使用搭载二维条码管自动化液体处理程序。虽然ŧ碟刹时间来建立较难，导致了前期投资购买仪器，从长远来看，这些因素将会由生产力的提高和检测的重复性进行补偿。事实上，几组先前报告的自动液体处理器的成功整合到他们的免疫或类似的应用程序21,22的工作流程。对于流式细胞仪分析的自动化解决方案也可从商业来源（FACS SPA三，自动鸡尾酒制备工作站，和FlowStainer）。这进一步表明有用于免疫自动鸡尾酒制剂极其需要。
掌握这一技术后，我们设想，全自动全血免疫的发展将进一步降低实验对实验变异，可能使全血免疫即使是在多中心临床试验设置23可行的。用裂解是我们已经开始^ h助手自动裂解和洗涤步骤。我们还设想，抗体的二维条码管的体积和试剂分的跟踪自动化决心将大大提高分别抗体的库存和在我们的方法中的质量控制。
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
Referencias
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O’Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
- BD biosciences. . Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
Citar este artículo
Koguchi, Y., Gonzalez, I. L., Meeuwsen, T. L., Miller, W. L., Haley, D. P., Tanibata-Branham, A. N., Bahjat, K. S. A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (108), e53485, doi:10.3791/53485 (2016).