Trasformazione di lievito probiotico e il loro recupero da gastrointestinali immunitario tessuti dopo sonda gastrica nei topi

microrganismi probiotici sono un intrigante potenziali mezzi di fornire in modo efficiente ed economicamente proteine ​​eterologhe al tratto gastrointestinale. Questi organismi sono in grado di sopravvivere passaggio attraverso il tratto gastrointestinale ancora non colonizzare ¹ che, consentendo dosaggio controllato e limitando l'esposizione al farmaco espresso. Inoltre, la possibilità di progettare facilmente questi organismi per produrre proteine ​​eterologhe su larga scala li rende un'alternativa economica alle particelle di consegna sintetici. Tuttavia, lo sviluppo di un tale approccio, come recentemente dimostrato mediante un ceppo auxotrophic di lievito Saccharomyces probiotici boulardii ^2, richiede la conoscenza di tecniche di laboratorio non tradizionalmente combinati all'interno di un dato studio, che vanno dal lievito e biologia molecolare alle tecniche di manipolazione degli animali e metodi immunologici. Così, sebbene le singole procedure descritte nel presente documento non sono di per sé romanzoprotocolli di laboratorio, l'obiettivo di questo manoscritto è di presentare una introduzione unificato per le tecniche necessarie per la prova sperimentale di lievito probiotico come veicoli di consegna della droga al tratto gastrointestinale murino. Fornito è una raccolta di protocolli essenziali per: 1) generazione di ceppi mutanti auxotrofi di lievito che può facilmente essere manipolato geneticamente; 2) la trasformazione di colture di lieviti per esprimere la proteina eterologa; 3) la somministrazione di lievito ricombinante per l'intestino tramite sonda gastrica; e 4) il recupero di vitale lievito probiotico ricombinante dall'intestino murino e la valutazione della loro espressione della proteina eterologa.

In primo luogo, anche se esistono numerosi metodi di selezione positivi e negativi per la manipolazione delle specie di lievito, selezione negativa ad esempio attraverso l'uso di marcatori auxotrofi aumenta l'efficienza e la facilità con cui il lievito può essere trasformata e selezionato. selezione positiva dei trasformanti che utilizzano antibiotici, in collaborazionentrast, aumenta significativamente il costo di manipolazione lievito. Inoltre, la selezione di lievito su supporti solidi antibiotici contenenti può consentire un aumento della crescita di fondo non trasformate colonie relativi alla selezione di lievito auxotrophic su goccia sintetica fuori terreni solidi (osservazioni non pubblicate). lievito auxotrophic è ceppi che mancano di enzimi fondamentali per la sintesi di amminoacidi essenziali o uracile. Tale lievito può crescere solo se integrato con il metabolita mancante o gene metabolica, consentendo in tal modo la selezione negativa quando il lievito è placcato sul calo sintetico fuori media che manca il metabolita essenziale. Molti Saccharomyces cerevisiae comunemente utilizzati ceppi di laboratorio sono infatti già mutanti auxotrofi ^3. Industriale, clinica, e ceppi di lievito probiotici, tuttavia, sono tipicamente prototrofici con la capacità di sintetizzare tutti i nutrienti necessari. Per consentire una più efficace manipolazione genetica di tale lievito, i geni auxotrofi possono essere selettivamente miratigenerare ceppi che possono essere selezionati senza antibiotici. Il targeting specifico di geni marcatori auxotrofi può essere raggiunto attraverso distruzione genica PCR-mediata affidamento su ricombinazione omologa o, più recentemente, attraverso CRISPR / Cas9 mira ^4-6. In alternativa, mutagenesi UV può generare rapidamente mutanti auxotrofi anche in ceppi di lievito per i quali la trasformazione con più plasmidi è tecnicamente difficile ^7. Mentre PCR targeting e CRISPR / Cas9 sono stati descritti ampiamente altrove, presentato nella prima parte di questo manoscritto è un protocollo dettagliato che descrive un approccio mutagenesi UV per creare ceppi auxotrofi che permetteranno di selezione negativa, piuttosto che la selezione antibiotica positivo di trasformanti lievito.

Il successivo passo necessario l'uso di tali ceppi auxotrofi consegna orale di proteine ​​eterologhe è il lievito trasformazione con DNA plasmidico. Dal momento che la prima trasformazione di successo di voti a favoret sferoplasti riportati per Saccharomyces cerevisiae nel 1978 ^8, numerose modifiche sono stati caratterizzati per aumentare l'efficienza e la facilità con cui le specie di lievito possono essere geneticamente modificate. Uso di elettroporazione per la trasformazione di successo di DNA in S. cerevisiae è stato descritto nel 1985 ⁹ e da allora è stato migliorato tramite l'aggiunta di incubazione 1 M sorbitolo al osmoticamente cellule di supporto ^10. Efficienza elettroporazione è stato inoltre dimostrato che in relazione alla specie di lievito e ceppo, numero di cellulare e fase di crescita, di volume elettroporazione, intensità di campo, e tamponi specifici ^11. Litio acetato (LiOAc) trasformazione, originariamente descritto da Ito et al. ^12, è tra i protocolli di trasformazione più comunemente utilizzati in quanto non richiede particolari attrezzature. Ulteriori analisi hanno dimostrato che l'efficienza di LiOAc lievito trasformazione aumenta notevolmente quando le cellule vengono raccolte a metà log fasedi crescita e sono calore scosso in presenza di polietilenglicole (PEG) e DNA a 42 ° C ^12. L'incubazione di intero lievito intatto con PEG è essenziale per la trasformazione efficiente, eventualmente migliorando attacco del DNA alla membrana cellulare, nonché tramite altri effetti sulla membrana ^13. Litio si aumenta la permeabilità delle cellule intatte ^14. Sebbene la maggior parte di laboratorio S. cerevisiae può essere facilmente trasformato utilizzando LiOAc trasformazione ^3, altre specie di lievito possono essere trasformati più efficiente utilizzando protocolli alternativi. Pichia pastoris, per esempio, è più efficiente trasformato tramite elettroporazione anziché LiOAc trasformazione ^13. È fondamentale, quindi, per testare multipla metodi di trasformazione e di ottimizzare tempi di incubazione e concentrazioni dei reagenti quando si tenta di modificare geneticamente un ceppo di lievito non caratterizzato. Questo manoscritto descrive così sia LiOAc transformation ed elettroporazione come tecniche per la trasformazione di mutante auxotrophic e wild type S. boulardii. I lettori interessati sono diretti alle recensioni recenti per la descrizione approfondita dell'evoluzione di lievito trasformazione, protocolli alternativi, e ulteriori discussioni di possibili meccanismi di azione ^13,15. Trasformazione di lievito con plasmide codificante una proteina facilmente rilevabile è inoltre essenziale per test a valle per garantire un'adeguata espressione e la funzione della proteina eterologa. Myriad proteine ​​diverse possono essere selezionati a seconda dello scopo finale dello studio terapeutico e gli anticorpi disponibili per il rilevamento di proteine ​​di immunoblotting, ELISA, e altre tecniche. Protocolli per queste tecniche sono state accuratamente descritto altrove ^16,17, e possono essere utilizzati per determinare i livelli di produzione di proteine ​​eterologhe dal lievito trasformato in confronto a curve standard. Ai fini della dimostrazione e per mostrareproduzione di successo di una proteina molto comunemente usato in biologia lievito, questo manoscritto presenta trasformazione con proteine ​​plasmide codificante fluorescente verde (GFP), che consente la successiva rivelazione utilizzando microscopia a fluorescenza.

Altrettanto importante per la produzione di organismi probiotici che esprimono la proteina eterologa è la corretta gestione e rilevazione di questi microrganismi all'interno dei tessuti gastrointestinali, come descritto nelle parti tre e quattro. La somministrazione di lievito ricombinante tramite gavage orale consente di erogazione di quantità controllate di lievito direttamente nello stomaco, da cui C57BL / 6 topi sono naturalmente incapaci di vomito ^18. Tuttavia, la manipolazione degli animali improprio e sonda gastrica può portare a danni esofagea e perforazione, perforazione gastrica, somministrazione tracheale, e polmonite da aspirazione ^19,20. scarsa tecnica e l'inesperienza può, inoltre, aumentare la variabilità nella risposta immunitaria murini e resu sperimentaleLTS, che sono stati attribuiti allo stress degli animali sulla sonda gastrica ^21,22. Pratica nella tecnica adeguata può attenuare quindi non solo disagio animale, ma può anche aumentare la precisione dei risultati sperimentali. Questo manoscritto descrive e dimostra la movimentazione degli animali e sonda gastrica per la somministrazione di dosi controllate di lievito ricombinante.

Infine, è fondamentale per confermare il successo di consegna di lievito ricombinante analizzando tessuti linfoidi per la presenza di lievito e proteine ​​eterologhe. I tessuti immunitarie gastrointestinali che possono più facilmente e prevedibilmente essere esaminata per la presenza di lievito sono patch di Peyer. Placche di Peyer sono organi linfoidi secondari lungo l'intestino tenue che sono i siti principali della mucosa induzione risposta immunitaria ^23. Gli antigeni dal lume vengono trasferiti attraverso transcellularly microfold cellule (M) nell'epitelio e vengono rilasciati nel patch di Peyer, quindi esponendo racchiudered cellule presentanti l'antigene di intestinali contenuto luminale. Sebbene l'assorbimento di particelle attraverso l'epitelio intestinale può essere ottenuto anche con cellule caliciformi, queste cellule hanno dimostrato di prendere soltanto particelle inferiore a 0,02 micron di diametro ^24. Dendriti transepiteliale estesi da cellule dendritiche CD103 ⁺ (DC) anche richiedere fino piccole particelle dalla intestinale lume ^25; tuttavia, attualmente non esistono rapporti che dimostrano che CD103 ⁺ DC occupano particelle più grandi di batteri. Così, intatto lievito probiotico, di dimensione media tra 3-6 micron di diametro, hanno più probabilità di essere ripreso da cellule M e trasferito alle patch di Peyer. Qui descritto è un protocollo per la raccolta e lo screening delle placche di Peyer di vitale lievito ricombinante, anche se questa procedura può anche essere facilmente adattato per valutare l'assorbimento di batteri probiotici.

In sintesi, la valutazione ricombinante lievito probiotico per la consegna delproteine ​​rapeutic per l'intestino richiede padronanza di tecniche di laboratorio che misurano biologia molecolare alla movimentazione degli animali e immunologia. protocolli qui presentati sono per 1) la generazione e la proiezione di ceppi di lievito auxotrofi che può essere facilmente negativamente selezionato senza antibiotici, 2) protocolli alternativi per trasformare il lievito e consentono l'espressione di proteine ​​eterologhe, 3) dimostrazioni di corrette tecniche di manipolazione degli animali e sonda gastrica per consegna intragastrica di lievito ricombinante, e 4) protocolli per la dissezione di patch di Peyer e lo screening di vitale lievito ricombinante e proteina eterologa funzionale. Insieme, questi protocolli consentiranno la generazione e la verifica di un ceppo di lievito probiotico in grado di erogare proteina terapeutica eterologa al tratto gastrointestinale.