JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

Parkinson Brains gelen Çözünür ve çözünmez alfa-sinüklein Sıralı Ekstraksiyon

Published: January 05, 2016
doi:
10.3791/53415
1Reta Lila Weston Institute of Neurological Studies,UCL Institute of Neurology

Summary

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

Abstract

Alfa-sinüklein (α-sin) proteini bol esas olarak nöronlar içinde ifade edilir ve farklı şekillerde bir dizi mevcut olduğu – monomerler, tetramerler, oligomerler ve fibrillerin. Hastalık sırasında, α-sin proteini daha fazla sayıda çözünmez hale getirme eğiliminde oligomerleri ve yüksek moleküler ağırlıklı agregaların meydana getirmek üzere uygun değişikliklere uğrar. Anormal toplu α-sin Parkinson hastalığı (PH), Lewy organları (LCD) ve çoklu sistem atrofisi (MSA) ile demans nöropatolojik özelliğidir. Biyokimyasal karakterizasyon ve artan deterjan gücü ve yüksek hızda ultrasantrifüjleme ile çözünmez α-syn kullanarak tamponların analiz hastalığın ilerlemesi ile ilişkili α-sin patolojinin gelişimini belirlemek için güçlü bir araç sağlar. Bu protokol ölüm sonrası insan beyin dokusunun giderek çözülmez / toplu α-syn izolasyonunu anlatmaktadır. Bu metodoloji, normal ve anormal a çalışmalarına değişikliklerle uyarlanabilirFarklı α-syn mutasyonlar barındıran transgenik hayvan modellerinde hem de ilgili patolojileri ile ilişkili proteinlerin anormal, fibriler birikintilerin, özelliği diğer nörodejeneratif hastalıklarda -SYN biyolojisi.

Introduction

Birçok nörodejeneratif hastalıklar arasında ortak anahtarı, patolojik özelliklerinden biri bir protein / hastalığın spesifik bir şekilde 1 oluşur anormal protein agregalarının oluşmasıdır. Böylece, Alzheimer hastalığı (AH) nöronların içindeki karakteristik ekstranöronal amiloid beta plaklar ve toplulaştırılmış hiperfosforile tau mevduat vardır; Lewy Bodies intranöronal kapanımlar olan (Liderler), ve ayrıca Lewy neurites (LN) Lewy organları (DLBs) 2-4 ile PD PD demans ve Demans denilen distrofik nöronal süreçleri içinde toplu α-syn mevduat. Anormal α-syn mevduat da MSA 5 glial sitoplazmik inklüzyonlar damgasını lezyonlar görülür. Huntington hastalığında, orada karakteristik Poly-Q yatakları ve anormal Tar DNA protein-43 ve sarkom proteinleri (FUS) erimiş Frontotemporal demanslar biriken bağlayıcı. Önemli olarak, PD, α-sin geni mutasyonları Cau bulunmuşturPD 6-11 dominant se otozomal. Ayrıca, α-sin gen triplication 12 ve çoğaltılması 13 de böylece PD patomekanizmaların artan α-sin ifadesini bağlayan ailesel PD neden olur. Özellikle, ailesel ve sporadik hem PD olgular α-sin patoloji 14 anormal mevduat liman. PD Güncel mevcut tedaviler palyatif sadece ve durdurma ya da amansız bir hastalık ilerlemesini geciktirmek üzerinde hiçbir etkisi yoktur.

α-sin bol insan beyninde ifade ve toplam beyin proteininin yaklaşık% 1'ini yapar. Bu nöronların içindeki daha özel olarak mevcut ancak glial hücreleri içinde daha düşük miktarlarda da olsa var olabilir. Bir tartışmalı nokta rastgele bir monomer 15 veya katlanmış bir tetramer 16 olarak var olabilir α-syn yerli yapıdır. Hastalık sırasında, α-sin o katlanan almayı sağlar şeklini değiştirir ve bu süreç hastalığın pathoge neden olduğu düşünülmektedirNesis. Α-syn ve hastalığın patofizyolojik yönlerini içine soruşturma birkaç yıl olmasına rağmen, hastalık mekanizmaları kesin nedenleri 14 zor kalmıştır.

Parkinson beyinlerin otopsi analizleri kullanılarak yapılan çalışmalar bugüne kadar α-syn sporadik PH ve aynı zamanda hem LRRK2 gen 17-22 mutasyonlarla ilişkili PD normal ve anormal biyoloji ile ilgili önemli ipuçları vermiştir. Burada, çeşitli derecelerde α-syn agrega liman insan post-mortem PD beyin dokusunda giderek çözünmez α-syn mevduatlar için bir biyokimyasal çıkarma protokolü (bkz şeması Şekil 1'de sunulan) tarif edilmiştir. Bu teknik aynı zamanda diğer nörodejeneratif hastalıklar 23,24 için ortalama proteinleri çalışma tamponu bileşimlerinde değişikliklerle ve aynı zamanda transgenik hayvan beyin dokusu 25-27 den adapte edilebilir. Uyarlamalar ana dikkate solubi farklılıklar vardırğı ve bazıları, ilgili proteinlerin toplam miktarları, esasen, nükleer ve FUS 28 için gösterildiği gibi, en uygun çıkarılması için yüksek tuzlu tampon gerekebilir.

Protocol

Otopsi beyin dokusu nörolojik bozukluklar için Kraliçe Meydanı Beyin Bankası bağışlandı, University College London, etik onaylı protokolleri kullanarak Nöroloji Enstitüsü, insan dokusu yetkilisi tarafından verilen bir lisans altında araştırma için depolanan (HTA) İngiltere (no. 12198). Bu protokol (Tablo 1) için kullanılan olguların listesine bakın. Tamponlar 1. Hazırlık 1X TBS (Tris-tamponlu tuzlu su) tamponunu hazırlayın: 500 mM Tris-HCI, pH 7.4 ve 1.500 mM NaCI stok çözeltisi olarak 10X TBS hazırlayın. Üzerinden 60,5 g Tris-CI, pH 7,6 ve yüksek saflıkta 800 ml su içinde 87,6 g NaCI tartılır. 1 M HCl ile pH ayarlayın ve 1 L. son stok hacmi yapmak Damıtılmış su içinde stoğu 10 kez seyreltilmesi ile 1X TBS nihai konsantrasyonu hazırlayın. Ekle proteaz inhibitörleri (PI), (50 ml tampon için 1 tablet) ile Phos verici fosfataz inhibitörü tablet (1 tablet ml tampon 10) başınaproteaz ve fosfataz spesifik olmayan enzimatik işlemlerden etkilerini ortadan kaldırmak. Not: Burada, üreticinin talimatlarına uygun olarak kullanılabilecek Roche tabletler, ancak eşit şekilde diğer ticari olarak temin edilebilen inhibitörleri inhibitörlerinin kullandık. (PH 7,4), 1X TBS ile / Sodyum dodesil sülfat v (SDS) w tamponu% 5 ekleyerek TBS-SDS tamponu hazırlayın. SDS çözündürülmesi için bir manyetik karıştırıcı kullanılarak, sabit karıştırma ile 60 ° C'ye kadar çözelti ısıtılır. 8 M / 1X TBS-SDS tamponu için hacim (pH 7.4) bir son konsantrasyona kadar üre eklenmesi ile TBS-SDS-üre tamponu hazırlayın. Üre çözülmesi için bir manyetik karıştırıcı üzerinde sürekli karıştırılarak 60 ° C'ye kadar çözelti ısıtılır. 2. Örnek Homojenizasyon ve Diferansiyel Ultrasantrifügasyon Not: işin şu kısmı HTA İngiltere kurallarına göre insan beyin dokusunun işlenmesini gerektirir. Yerel standart operasyon prosedürlerinin tüm ti izlenmektedirmes. Beyin örnekleri negatif basınçta muhafaza edilen bir microcabinet içinde homojenize dondurulmuş beyin blokları ve doku malzemeden kesilir. Tek kullanımlık önlük eldiven, yüz maskeleri, aşırı ayakkabının koruyucuları ve koruyucu gözlük işlem boyunca giyilir. İnsan dokusu atık bertaraf etmek üzere 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav sonra atılır. Diyezler (bisturi bıçakları) çevreleme ve güvenli bertaraf için uygun bir kesici kapta bertaraf edilmektedir. (Bazal ganglion bölgesinden ağırlığı yaklaşık 0.5 g), dondurulmuş insan dokusu bir parça almak ve hızlı bir şekilde, küçük bir petri kabı ve steril bir bisturi bıçağını kullanarak buz üzerinde küçük parçalara (yaklaşık 1 ila 2 mm) içerisine kıyma. Her bir numune için ayrı petri-çanak ve neşter bıçak kullanın. 15 ml'lik bir tüp içinde kıyılmış doku toplayın ve tüpe buz soğukluğunda 1XTBS tamponu 10 hacim ekleyin. 10 sn için 20.000 rpm'de mekanik bir homojenleştirici kullanılarak örnekleri homojenize. 2 dakika için buz üzerinde soğutulur. Bu adımı üç kez tekrarlayıns. Not: homojenize edildi örnekleri kadar ısıtılır değildir ki bu yapılır. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleme ile açıklığa kavuşturulması. Olmayan homojenize malzeme pelet atın. Süpernatant (ham homojenat) alın, (tüp boyutu rotor büyüklüğüne bağlıdır) santrifüj tüplerine polikarbonat ve dikkatli dengelemek ekleyin. 4 ° C'de 1 saat boyunca 100,000 x g'de santrifüjleyin. Bu TBS-çözünebilir fraksiyon olarak süpernatant saklayın. Yıkama 4 ° C'de 15 dakika boyunca 100,000 x g'de 1X TBS tamponu ve santrifüj her beş hacim içinde iki kez pelet. Süpernatantlar atın. Oda sıcaklığında 1X TBS-SDS yaklaşık 5 hacim 20 KHz'de 10 saniye boyunca sonike pelet nihai pelet yeniden süspanse edin. Not: SDS içeren tampon numunelerinin eklenmesi SDS çökelmesini önlemek için 10 ° C 'de getirilmesi gerekmektedir önce. 25 ° C'de 30 dakika boyunca 100,000 x g'de Ultracentrifuge. Bu inci gibi süpernatant saklayıne çözünebilen bir kısım SDS. Yıkama oda sıcaklığında 1X TBS-SDS tamponu içinde iki kez 5 hacim pelet. Santrifüj 25 ° C'de 15 dakika boyunca 100,000 x g'de her zaman. Tam çözünürlüğünü elde etmek için 10 saniye boyunca 20 KHz ayarlanmış bir sonikatör kullanılarak 1X TBS-SDS-üre tamponu 50 ul nihai pelet çözünür; Bu üre, çözünür fraksiyonu olarak adlandırılır. Imalatçının protokolüne göre, ticari bir protein tahlil kiti kullanılarak toplam protein içeriğinin her fraksiyonu deneyi. Protein tahlili tepkin maddeler ile uyumluluk sağlamak için 1X TBS tamponu ile 1: TBS-SDS-üre numuneleri 1 seyreltin. -80 ° C'de küçük kısımlar (20 ul) Freeze örnekleri donma-erime döngülerinden azaltır. Not: örnekler% 10 gliserol eklenmesi -80 ° C de, uzun süreli depolama için tavsiye edilir. Örnekleri ve Analiz Sonuçlarının 3. İmmünoblotting 10-kuyu% 4-12 Bis-Tris poliakrilamid jel üzerinde TBS, TBS-SDS ve TBS-SDS-Üre özlerinden Run örneklerstandart teknikler kullanılarak tampon olarak MOPS ile. Bkz Gallagher ve Chakravarti (2008) ayrıntılı bir western blot protokolü için 29. TBS ve SDS ve üre fraksiyonları bir molekül ağırlığı markeriyle birlikte her şerit üzerine yüklenebilir Her numunenin protein 10 ug. 1 saat süre ile veya yükleme tampon mavi boya, jel tabanına erişmesine kadar 200 V jel çalıştırın. Elektroforetik naylon zarları 28 üzerine jeller proteinleri transfer,% 20 metanol ihtiva eden transfer tampon maddesi içine ilk% 100 metanol ve ardından önceden ıslatılmış. Protein, yan ve Moleküler Ağırlık boyut işaretleyicilerinin oryantasyonunu belirlemek için lekesi üzerinde bir tanımlama işareti sağlar. Islak filtre kağıdı yanında membranı ile jel Sandwich. Membranın doğru yerleştirilmesi jeli ve anot arasındaki zarla önemlidir. 40 V 2 saat için aktarımı gerçekleştirmek 1X PBS-Tween (1X PBS-T) tamponu Makyaj: 200 ml PBS 1 tabletSu 0.01 M fosfat tamponu, 0.0027 M potasyum klorür ve 0.137 M sodyum klorür, pH 7.4 elde etmek için. 70 rpm'de sallama ile 30 dakika için 1X PBS-T içinde% 5 BSA çözeltisi içinde membran bloke eder. Bu zara birincil antikor, spesifik olmayan bağlanmanın engeller. (1X PBS-T ile yıkanmıştır, bir dizi ve ardından (4 ° C 'de O / N) 750 seyreltme: 1 ile, α-sin birincil antikor Syn-1 (fare monoklonal antikoru BD Biosciences) 6 ml protein blot Probe 3 x 5 dakika her zaman) 28. 1 ikincil antikor konjuge uygun HRP ile leke inkübe: 2000 seyreltme 30 dakika boyunca. 1X PBS-T ile bir dizi yıkama (3 x 5 dk her zaman) uygulayın. Karanlık bir odada 15 saniye geliştirilmiş chemiluminescence çözeltisi lekelerini daldırın. Bir ışık geçirmez kaset protein tarafı yukarı ile leke karşı sarılmak film ve yer otoradyografisi filmleriyle Kapak lekeler uygun sinyalleri (uygun boyut bantları) yakalamak için. Otomatik geliştirici olarak otoradyografisi filmleri geliştirin. Not: Lekeler aynı zamanda otomatik bir geliştirici makinesi kullanılamaz durumda ticari bir kaynaktan bir geliştirici ve fixer kullanılarak elle geliştirilebilir. Western blot 6 ml sabit bir α-syn antikoru sinyalin leke şerit çalkalanarak 10 dakika boyunca tampon sıyırma batı leke inkübe edin. 8000 seyreltme: 1 beta-aktin primer antikor (fare monoklonal) ile 3.6.2 için adımları 3.43 izleyin. Tarama ve kantitatif amaçlı NIH ImageJ (ücretsiz indirilebilir bir yazılım) kullanarak bir Tiff görüntü ve ölçü yoğunlukları içine son görüntüyü dönüştürmek. Not: Yazılım, ilgi nispi alan (uygun büyüklükte bantlar) yoğunluklarının okuma sağlar ve veri ya da rasgele birimleri ya da α-sin yoğunluk / β-aktin (bir ev tutma geni) bir oranı olarak ifade edilebilir Bir ev tutma geni (üre çözünür örneklerde olduğu gibi) geçerli değil ise kendi. </li>

Representative Results

TBS, SDS ve Şekil 1 'de gösterilen protokol takip bazal gangliyonlar elde Üre çözünür proteinler jeller üzerinde yürütülmüştür ve α-sin Syn-1 fare monoklonal primer antikor ile bağışık lekelenmesi edildi. TBS çözünür fraksiyonlar incelenmiş PD ve kontrol olgularında monomerik α-syn (~ 14 KDa türleri) (Şekil 2A) varlığını gösterdi. SDS çözünür fraksiyonları aynı zamanda düşük maruziyet blot (Şekil 2C) görüntülenen olarak ele olguların her üç alt tiplerinin bol monomerik α-syn gösterdi. PD durumlarda da oligomerler (Şekil 2C) olması muhtemeldir yüksek maruz kalma lekesi üzerinde görülen daha yüksek moleküler ağırlıklı (MW) α-syn türler göstermiştir. PD olgulardan üre çözülebilir fraksiyonları α-syn monomerlerin, oligomerlerin ve davaları kontrol grubuna kıyasla toplulaştırılmış türlerin yüksek miktarlarda gösterdi. Neokortikal idiyopatik PD olgular aggreg yüksek miktarlarda göstermek Limbik olgular çözünmez α-syn orta düzeyde göstermek iken ated, türler α-syn. Hem idiopatik PD olgulardan SDS ve üre fraksiyonları değişken 12 kDa'da kesik α-syn ürünlerin düzeyleri ve 6 kDa 20 anlatıldığı gibi göstermektedir. Buna karşılık, kontrol olgusu herhangi çözülmeyen veya kümelenmiş α-syn (Şekil 2E) yoktu. Yarı nicel yoğunluğu ölçümleri neokortikal ve limbik PD durumlarda toplanan α-syn çözünmeyen doğası (Şekil 2B, 2D, 2F) gösteren α-sin immünohistokimya kullanılarak categoriesd olarak LB yükün miktarını yansıtmaktadır. Şekil 1. çözünmez α -SYN ekstraksiyon prosedürü şematik.rYer = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2. PD gelen α -SYN seviyelerde Temsilcisi imünoblotların ve insan dokusu kontrol. TBS, SDS ve üre çözünür fraksiyonlar bazal ganglionlar (kontrol) idiyopatik PD vakalarının ve nörolojik olarak normal (PD durumlarda α-syn patoloji barındıran bölgede) den beyinleri western immüno kullanılarak α-syn varlığı için analiz edilmiştir. Protein 10 ug her bir şeride yüklendi. TBS fraksiyonlar (A) olarak, esas olarak α-sin monomerler, her durumda mevcuttur. SDS fraksiyonlar (C) olarak, α-syn bazı oligomerleri özellikle PD dokusunda monomerleri ile birlikte görülür. Üre fraksiyonları (C) monomer, oligomer ve toplanmış α-syn olarak değişken PD olgu Yansıtıcı olarak ifade edilmiştirg, kendi LB yükü. Nörolojik normal kontrol numuneleri monomerik α-syn, sadece az miktarda varlığını göstermektedir. Yüksek LB yük ile vakaların bazılarında görülen α-syn olası bozunma ürünlerini unutmayınız. Katı ok başı α-syn monomerik formunu temsil eder. * Muhtemelen daha önce 20,26 açıklandığı gibi α-syn bir C-terminal kesik formunu temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Vaka Seks Ölüm yaş yaşı otopsi gecikmesi (saat) dokusunun pH değerinin, Neokortikal 1 M 82 40 6.3 Neokortikal 2 F 75 35.3 6.4 Limbik 1 M 81 28.5 6.2 Limbik 2 F 79 36.5 6.2 Kontrol 1 M 80 38 6.1 Kontrol 2 F 83 32.5 6.3 Kullanılan olguların Tablo 1. Sınırlı demografik

Discussion

Bu makale denatüre jel çalışma koşulları kullanılarak hastalıklı beyinleri ekstraksiyon ve monomerik, oligomerik diferansiyel çözünürlük özelliklerinin incelenmesi ve kümelenmiş α-syn için biyokimyasal protokol tanımlamaktadır. Bu çalışma için iyi bilinen bir tekniktir toplu α-sin 17, 18, ​​20, 21 kendi doğal formunda normal eriyebilir ancak hastalığın ilerlemesi ya da genetik mutasyon amiloidojenik veya yüksek çekiş özelliklerinin elde protein. Bununla birlikte, bazı grupları (8 veya% 10 yerine% 5%) 21,22, 30. SDS α-sin membran bağlanmış form içerebilir oligomerler, bir anyonik deterjan ve çözünürleştiren onların tampon SDS konsantrasyonlarında hafif varyasyonlar kullanmış α-sin, üre, oysa kaotropik reaktifi α-syn 20 çözünmeyen toplanmış ve fibriler veya amiloidojenik formları denatüre. Bu bağlamda Paleologou ark 31 tarafından sistematik bir çalışma istikrar incelendiα-syn oligomerler ve üre değişen konsantrasyonları ile fibrillerin (6,5-8 M) ya da SDS (0,25-2%) ve rapor üre konsantrasyonu yüksek olan SDS konsantrasyonlarda stabil ama oligomerleri. Α-syn oligomerler ve fibriller için spesifik onların FILA-1 antikoru, denatüre edici olmayan koşullar altında 6,5 ​​M üre konsantrasyonlarında fibrillerin yüksek konsantrasyonlarda tespit edilmiştir. Bu protokolde kullanılan tampon konsantrasyonlarının yakın Culvenor et al edilmiştir ne yansıtır. (1999) 32.

Çözünmez α-syn biyokimyasal çıkarılması için anatomik beyin bölgelerinin özenle seçilmiş olmalı ve bu hastalığın ilerlemesi 33,34 bağlı α-syn LB ve LN yükünü yansıtmalıdır. Burada kullanılan vakalar McKeith göre PD ilerlemesinin geç ve bir ara aşamadan yansıtan PD neokortikal ve limbik alt tipleri gelen bazal ganglion örnekleri 34 ctriteria vardır. Kraliçe Meydanı Beyin Bank, beynin bir yarısırutin histokimyasal analizler için formalin sabit ve diğer yarısı dikkatle farklı anatomik bölgelere içine disseke ve flaş dondurulmuş ve biyokimyasal ileri ve DNA / RNA analiz çalışmaları için -80 oC dondurucular saklandı. Nöropatolog tarafından beyinleri ve diseksiyon formalin fiksasyonu takiben, immunhistokimya arşivlenmiş α-syn antikoru ve sonuçları kullanılarak yapılır. Ayrıca rutin olarak, beyin dokusunun pH değerinin, beyin dokusunun agonal durumunun bir ölçüsü olarak girişte ölçülür. Bu biyokimyasal analiz için doku koruma kalitesi için sağlam bir temel oluşturur.

Bizim burada verileri daha SDS kontrollere göre PD durumlarda çözünür α-sin monomer olduğunu göstermektedir; Özellikle Neokortikal PD olgular limbik PD çeşitli kıyasla daha yüksek α-sin yükü vardır. Neokortikal vakalar gibi frontal ve parietal cor olarak neokortikal bölgelerdeki PD α-sin patolojinin daha ilerlemesini temsil33,34 göçmenlik ve. Limbik PD olgular amigdala, transentorhinal ve singulat bölgeleri olarak bazal ön beyin / limbik bölgelerde alanlarda yüksek LB puanları. Anlamlı veriler ve istatistiksel analiz için birer kohorttaki en az 4 vaka çalıştırmanız gerekir. Aynı şekilde biz burada sunulan leke verilerinin istatistiksel analizini teşebbüs değil.

Aynı zamanda farklı antikorlar farklı biçimler / yüksek mertebeden α-syn oligomerler bileşimini tanıyabilir ve her biri kendi nispi hassasiyet ve tercih olabilir belirtmek gerekir. 4 farklı α-sin antikorlar (Syn-1, BB, Onco ve LB509) α-sin oligomerler / agrega en az değişmektedir sonuç verir olduğunu göstermektedir burada Tong ve ark., 29 sonuçlarından açıkça görülmektedir. Bu α-syn antikoru epitop ya N-terminal veya C bulunur bağlı olarak varyasyon rağmen α-syn monomerler Tüm 4 antikorlar tarafından benzer oranlarda kabul edildi29 terminal. Türler 20,21 sinüklein α-Benzer şekilde, fosfo-spesifik antikorlar, alfa sinüklein farklı yüksek moleküler ağırlıkların belirlenmesi. Burada anlatılan protokolde, yüksek özelliğine sahip antikor Syn-1 19-21 kullanılmıştır.

Ancak, bu hücrelerde aynı zamanda proteinin aşırı ekspresyonunu ve demonte antikoru preabsorption deneyleri ile western blot üzerinde yeni antikor doğrulama ve dikkate alınması önemlidir.

Bu α-sin ve veya stabil olmayan dörtlü α-sin formların küçük fragmanlarının belirlenmesi için araştırmacılar tarafından uygulanmış olan diğer varyasyonlar dikkate alınması önemlidir. Bu tetramerleri 36 stabilize α-syn 35 veya çapraz bağlama maddeleri ile Örnek homojenatlarında tedavisinde tepe bölümü kesik biçimlerinde korumak için PBS içinde% 0.4 PFA ile membran hafif tespit içerebilir.

Otopsi TI kullanarak proteinlerin doğru biyokimyasal değerlendirmessue enzimatik protein yıkımı ve modifikasyon minimize gerektirir. Bu durum kohortlardan içinde eşleştirilmiş örnekler kısa otopsi gecikme ile doku kullanabilir ve / veya seçmek için bu nedenle tavsiye edilir. Α-sin immünohistokimya standart antikorlar kullanılarak immünohistokimya yalıtım protokolü başlamadan önce yapılmalıdır. Α-sin patolojinin ölçüde oldukça değişkendir ve seçilen bölgelere göre değişebilir. Her çalışma ile optimum verim için bir pozitif kontrol olarak bol patoloji bölgeleri seçmek için tavsiye edilir. Gerekli fosfataz inhibitörleri, proteaz inhibitörleri ve gerekirse kullanımı hücre lizizi sırasında meydana gelen ve 4 ° C 'de muhafaza örnekleri hücre içi proteazlar ya da fosfatazların serbest bırakıldıktan sonra önemlidir İstenmeyen enzimatik bozunmasını önlemek için.

Bu deneylerin toplu iş içinde numunelerin içi kullanıcı varyasyonları önlemek için eşit ve düzenli işlenir önemlidir; Birden çok frebu potansiyel fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlarını geri olabilir eze-eritme çevrimleri kaçınılmalıdır. Numunelerin çok sayıda inceleyen immunoblotlarda veri jelleri diğer tüm örneklerin ve bu örneğe başvurulan tüm verilere paralel olarak çalışmalıdır bir örnek, normalize olması gerektiğini olduğunda bir kritik nokta akılda tutulması. Bu birkaç blotlar arasındaki immunoblot verilerinin normalleşmesini sağlamak için yapılır. Bu bizim son çalışmada 22 benimsenen yöntemdir.

Düşük arka plan ECL tutmak için, benekler western blot protokolü esnasında herhangi bir zamanda kurumasına izin verilmesi gerektiği not edilmelidir. Bu ECL sinyalinin doygunluk yol açacaktır ve yanlış kantitatif yol açacaktır ek olarak, otoradyografi filmlerde çok uzun pozlama (> 10 dk) kaçınılmalıdır.

Bu, yukarıda protokol ortak laboratuvar reaktifler ve kullanılan oldukça basit bir tekniktirKumanda elemanları ve PD araştırma α-syn proteinin patofizyoloji araştırmak için değerli bir araç olabilir. Bu metodoloji, sadece α-sin transgenik hayvanlarda α-sin biyolojisi çalışmalarına uygun modifikasyonlar ile değil, aynı zamanda, AD, MSA, DLB, HD ve frontotemporaldementias gibi kümelenmiş proteinlerin anormal mevduat sahip diğer nörodejeneratif bozukluklar ile uzatılamaz. Ancak, burada tarif edilen Western blot verileri de α-syn 31 ile ilgili spesifik formlar için antikorlar kullanılarak enzim bağlı immünosorbent deneyleri kullanılarak onaylayabilir.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

I thank Dr Adamantios Mamais for extracting α-synuclein from human tissue and running of blots. This work was supported in part by a MRC Grant (MR/L010933/1) and in part by the Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) to the UK Parkinson’s Disease Consortium (UKPDC) whose members are from the UCL Institute of Neurology, the University of Sheffield and the MRC Protein Phosphorylation Unit at the University of Dundee. RB received funding from MJFox foundation for this work and is also funded by the Reta Lila Weston Trust.

Materials

Tris-HCL Sigma T5912
sodium chloride VWR 27800.291
SDS Fluka 71727
Urea Sigma U5378
Protease inhibitor tablets  Roche 04 693 116001
Phosphatase inhibitor tablets  Roche  04 906 837001
Phosphate buffered saline tablets  Sigma  P4417
Tween-20  Sigma P9416
NuPAGE MOPS SDS running buffer Invitrogen NP0001
NuPAGE transfer buffer Invitrogen NP0006-1
Hybond-P membrane  GE Healthcare RPN303F
Whatman 3MM filter paper Sigma WHA30306185
Bis-tris gels 4-12%  Invitrogen  NP0322BOX
Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate Pierce 34080
Bio-RAD DC protein assay kit  Bio-Rad 500-0112
Thickwall Beckman Polycarbonate tubes Beckman 355630
Western blot stripping buffer Thermo scientific 46430
Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) BD Biosciences 610786
beta-actin primary antibody (mouse monoclonal  Sigma A5441
HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody Santa Cruz sc-2031
Bovine serum albumin Sigma A7030
Instrument Company Rotor/ model no 
Benchtop Ultracentrifuge Optima Max Beckman MLA-80
Sonicator Heat Systems XL20-20
Homogeniser Jenke and Kunkel TP18/10
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative disease a decade od discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10, 1055-1063 (2004).
  2. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, . M. A-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
  3. Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M., Goedert, M. Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. Proc Natl Acad Sci. 95, 6469-6473 (1998).
  4. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. Am J Pathol. 152, 879-884 (1998).
  5. Ahmed, Z., et al. The neuropathology, pathophysiology and genetics of multiple system atrophy. Neuroptahol Appl Neurobiol. 38 (1), 4-24 (2012).
  6. Ploymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science. 276, 2045-2047 (1997).
  7. Kruger, R., et al. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson’s disease. Nat Genet. 18, 106-108 (1998).
  8. Zarranz, J. J., et al. The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy Body dementia. Ann. Neurol. 55, 164-173 (2004).
  9. Proukakis, C., et al. A novel alpha-synuclein missense mutation in Parkinson disease. Neurology. 80 (11), 1062-1064 (2013).
  10. Kiely, A., et al. Synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson’s disease and Multiple System atrophy?. Acta Neuropathol. 125 (5), 753-769 (2013).
  11. Lesage, S., et al. G51D alpha-synuclein mutation causes a novel Parkinson-pyramidal syndrome. Ann Neurol. 73 (4), 459-471 (2013).
  12. Singleton, A. B., et al. Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science. 302, 841 (2003).
  13. Chartier-Harlin, M. C., et al. Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson’s disease. Lancet. 364, 1167-1169 (2004).
  14. Cookson, M. R., Hardy, J., Lewis, P. A. Genetic neuropathology of PD. Int J Clin Exp Pathol. 1 (3), 217-231 (2008).
  15. Fauvet, B., et al. α-synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and. Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer. J Biol Chem. 287, 15345-15364 (2012).
  16. Bartels, T., et al. α-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477, 107-110 (2011).
  17. Campbell, B. C., et al. Accumulation of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies. Neurobiol of Dis. 7 (3), 192-200 (2000).
  18. Campbell, B. C., et al. The solubility of alpha-synuclein in multiple system atrophy differs from that of dementia with Lewy bodies and Parkinson’s disease. J Neurochem. 76, 87-96 (2001).
  19. Miller, D. W., et al. Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson’s disease with SNCA locus triplication. Neurology. 62, 1835-1838 (2004).
  20. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
  21. Zhou, J., et al. Changes in the solubility and phosphorylation of alpha-synuclein over the course of Parkinson’s disease. Acta Neuropathol. 121, 695-704 (2013).
  22. Mamais, A., et al. Divergent solubility and aggregation properties in G2019S LRRK2 Parkinson’s disease brains with Lewy Body pathology compared to idiopathic cases. Neurobiol of Dis. 58, 183-190 (2013).
  23. Lashley, T., et al. A comparative clinical, pathological, biochemical and genetic study of fused in sarcoma proteinopathies. Brain. 134 (pt9), 2548-2564 (2011).
  24. Brelstaff, J., et al. Transportin-1: a marker of FTLD-FUS. Acta Neuropathol. 122 (5), 591-600 (2011).
  25. Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO reports. 3 (6), 583-588 (2002).
  26. Nuber, S., et al. A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats. Brain. 136, 412-432 (2013).
  27. Tofaris, G. K., et al. Pathological changes in dopaminergic nerve cells odf the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human a-synuclein (1-120): implications for Lewy Body disorders. J Neurosci. 26 (15), 3942-3950 (2006).
  28. Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
  29. Gallagher, S., Chakravarti, D. Immunoblot analysis . J Vis. Exp. (16), e759 (2008).
  30. Tong, J., et al. Brain alpha-synuclein accumulation in multiple system atrophy, Parkinson’s disease and progressive supranuclear palsy: a comparative investigation. Brain. 133, 172-188 (2010).
  31. Paleologou, K. E., et al. Detection of elevated levels of soluble α-synuclein oligomers in post-mortem brain extracts from patients with dementia with Lewy bodies. Brain. 132, 1093-1101 (2009).
  32. Culvenor, J. G., et al. Non-Aβ component of Alzheimer s disease Amyloid (NAC) revisited. American Journal of Pathology. 155 (4), 1173-1181 (1999).
  33. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol Aging. 24, 197-211 (2003).
  34. McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
  35. Lee, B. R., Kamitani, T. Improved immunodetection of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 6, e23939 (2011).
  36. Newman, A. J., et al. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 8 (11), e81314 (2013).

Tags

Alpha-synucleinParkinson’s DiseaseSequential ExtractionSolubleInsolubleBasal GangliaHomogenizationUltracentrifugationTBSSDSUrea

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Bandopadhyay, R. Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains. J. Vis. Exp. (107), e53415, doi:10.3791/53415 (2016).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image