パーキンソン脳からの可溶性および不溶性のα-シヌクレインの逐次抽出

死後脳組織が神経疾患のためにクイーンスクエア脳バンクに寄贈された、ロンドン大学、倫理的に承認されたプロトコルを用いて神経学研究所ヒト組織機関によって発行されたライセンスの下で研究のために保存（HTA）、英国（NO。12198）。このプロトコル（ 表1）に使用するケースのリストを参照してください。 バッファーの調製 1×TBS（トリス緩衝食塩水）バッファーを準備します。 500 mMトリス – 塩酸pHが7.4と1500 mMのNaClを含む原液として10倍のTBSを準備します。 うち60.5グラムのTris-ClでpHを7.6と高純度水の800ミリリットル中のNaClの87.6グラムを計量。 1MのHClを用いてpHを調整し、1 Lに、最終的な在庫量を作ります蒸留水に株式を10回希釈することにより1X TBSの最終濃度を準備します。 プロテアーゼ阻害剤を加える（PI）、（50 mlの緩衝液当たり1錠）及びフォス停止ホスファターゼ阻害剤錠剤（緩衝液10ml当たり1錠）にプロテアーゼおよびホスファターゼの非特異的な酵素作用の影響を排除。 注：ここでは、ロシュからの酵素阻害剤錠剤を使用しているが、同じように他の市販の阻害剤は、製造業者の説明書に従って使用することができます。 1X TBSへW / Vドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（pH7.4）でバッファ5％添加し、TBS-SDS緩衝液を準備します。 SDSを可溶化するために、磁気スターラーを用いて一定に攪拌しながら60℃に溶液を加熱します。 / 1×TBS-SDS緩衝液（pH 7.4）にV wを8 Mの最終濃度に尿素を加えることによって、TBS-SDS-尿素緩衝液を準備します。尿素を溶解し、マグネチックスターラーで絶えず撹拌しながら60℃に溶液を加熱します。 2.サンプル均質化および差動超遠心注：以下の作業の一部は、HTA UKの規則に従って、ヒト脳組織の取り扱いを伴います。ローカル標準操作手順は、すべてのTIで追跡されていますMES。脳サンプルを負圧に維持microcabinetで均質化凍結脳ブロックおよび組織材料から切除されます。使い捨てガウン手袋、フェイスマスク、オーバーシューズプロテクターと安全ゴーグルは、プロシージャ全体で着用されています。ヒト組織廃棄物は安全に処分するため、20分間121℃でオートクレーブ処理後に廃棄されます。シャープ（メスの刃）を包含し、安全に処分するために適切なシャープコンテナに配置されています。 凍結ヒト組織（大脳基底核領域から重量で約0.5グラム）のチャンクを取り、迅速に小さなペトリ皿や滅菌手術用メスの刃を使用して氷の上に小さな断片（約1mm 2）にミンチ。各サンプルの別々のペトリ皿とメスの刃を使用してください。 15mlチューブにみじん切りの組織を収集し、チューブに氷冷1XTBSバッファの10のボリュームを追加します。 10秒間20,000rpmで機械的ホモジナイザーを用いてサンプルをホモジナイズします。 2分間氷上で冷却します。このステップ3回繰り返します秒。 注：均質化しながら、サンプルが加熱されないように行われます。 4℃で5分間、1000×gで遠心分離することによって明らかにします。非均質化された材料のペレットを捨てます。 、上清（粗ホモジネート）を取るポリカーボネート遠心管に加える（チューブのサイズはローターのサイズに依存）、慎重にバランスをとります。 4℃で1時間、100,000×gで遠心分離します。 これは、TBS-可溶性画分であるとして、上清を保持します。 洗浄は、4℃で15分間、100,000×gで1×TBS緩衝液および遠心分離の5つのボリュームに2回ずつ時間をペレット化。上清を捨てます。 室温で1×TBS-SDSの約5倍量の20 kHzで10秒間ペレットを超音波処理することによって、最終的なペレットを再懸濁。 注：SDS含有緩衝液サンプルの添加はSDS沈殿を避けるために、10℃でもたらされるべきである前に。 25℃で30分間100,000×gで超遠心機。 これは番目であるとして、上清を保持eは可溶性画分をSDS。 ウォッシュは、室温で1×TBS-SDS緩衝液の5倍量の二回ペレット。 25℃で15分間100,000×gで遠心分離するたびに。 完全な可溶化を達成するために10秒間20 kHzで設定し、超音波処理器を使用して、1×TBS-SDS-尿素緩衝液50μlの最終ペレットを可溶化します。これは、尿素可溶性画分と呼ばれます。 製造業者のプロトコルに従って市販のタンパク質アッセイキットを用いて全タンパク質含量のために、各画分をアッセイ。タンパク質アッセイ試薬との互換性を可能にするために、1×TBSバッファーで1：TBS-SDS-尿素サンプル1を希釈します。 -80℃で少量のアリコート（20μL）中で凍結サンプルを、凍結融解サイクルを減少させます。 注：サンプルに10％グリセロールを追加すると、-80℃で長期保存することをお勧めします。 サンプルと分析結果の3イムノブロッティング 10ウェル、4〜12％ビス – トリスポリアクリルアミドゲル上で、TBS、TBS-SDSおよびTBS-SDS-尿素抽出物からの実行サンプル標準的な技術を使用してバッファを実行しているとしてMOPSを持ちます。詳細なウエスタンブロットプロトコルのギャラガーとチャクラバルティ（2008）29を参照してください 。 TBSとSDSおよび尿素分画のための分子量マーカーと一緒に各レーンにロード各試料からの10μgのタンパク質を。 1時間またはローディングバッファーからの青色色素がゲルの底に到達するまで、200Vでゲルを実行します。 電気泳動ナイロン膜28上にゲルからタンパク質を転送し、20％メタノールを含有する転写緩衝液中に最初に100％メタノールで、次いで、予め湿らせました。タンパク質側及び分子量サイズマーカーの向きを決定するために、ブロット上の識別マークを提供します。 湿った濾紙と一緒に膜を有するゲルを挟みます。膜の正しい配置は、ゲルとアノードとの間の膜とが重要です。 40 Vで2時間転送を行います 1X PBS-トゥイーン（1X PBS-T）バッファを構成する：200ml中にPBSを1錠を溶かし水は、0.01 Mリン酸緩衝液、0.0027 M塩化カリウムおよび0.137 M塩化ナトリウム、pHが7.4を得ました。 70rpmで振盪しながら30分間、1X PBS-T中の5％BSA溶液中で膜をブロックします。これは、膜を一次抗体の非特異的結合を防止します。 （1×PBS-Tで一連の洗浄に続いて（4℃でO / N）750希釈：1で、α-SYN一次抗体SYN-1（マウスモノクローナル抗体BD Biosciences社）を6 mlのタンパク質ブロットをプローブ3×5分ごとに）28。 1で適切なHRP結合二次抗体でブロットをインキュベート：30分2,000希釈。 1×PBS-Tで一連の洗浄（3×5分ごとに）を実行します。 暗い部屋で15秒間増強化学発光溶液中でブロットを浸し。ラップフィルムでブロットをカバーし、適切な信号（適切なサイズのバンド）をキャプチャするために、光を通さないカセットにタンパク質側を上にしてブロットに対してオートラジオグラフィーフィルムを配置します。 自動化された現像剤中のオートラジオグラフィーフィルムを開発。 注意：ブロットはまた、自動化された開発者のマシンが利用できない場合には商業的供給源からの現像液と定着液を使用して手動で開発することができます。 定数α-SYN抗体シグナルのブロットを取り除くために振盪しながら10分間ストリッピングバッファーウエスタンブロットの6ミリリットルでウエスタンブロットをインキュベートします。 8000希釈：1でベータアクチン一次抗体（マウスモノクローナル）を使用して3.6.2に至るまでのステップ3.43に従ってください。 スキャンおよび定量のために、NIH ImageJの（無料ダウンロード可能なソフトウェア）を使用して、TIFF画像と測定濃度に最終画像を変換します。 注：ソフトウェアは、関心の相対面積（適切なサイズのバンド）の濃度の読み取りを可能にし、データがいずれかの上の任意の単位として、またはα-SYN密度/βアクチン（ハウスキーピング遺伝子）の比として表すことができます。独自のハウスキーピング遺伝子は、（尿素水溶性サンプルの場合のように）有効でない場合。 </li>