Enriquecimento da membrana de Bruch de Olhos dador humano

Tecido do olho humano para fins de investigação consentido foi obtido a partir de Manchester Royal olho Hospital Banco olho a seguir à remoção da córnea para o transplante. O uso de tecidos humanos para a pesquisa foi de acordo com a Human Tissue Act (2004) orientações, e com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade (referência 11305). 1. Enriquecimento da membrana de Bruch Whole Limpar o espaço de trabalho em torno e por baixo do microscópio de dissecação com um desinfectante% (v / v) e, em seguida, limpar com 70% (v / v) de etanol. Garantir a seguir estão à mão: uma nova bisturi descartável, dois raspadores estéreis celulares (comumente utilizados na cultura de tecidos) e três pares de pinças (listadas aqui como A, B, e C, veja a lista de materiais). Colocar o globo ocular descartável numa placa de petri, a tampa de retenção para uso posterior. Usando uma nova bisturi descartável, remover qualquer nervo óptico residual, o que pode interferir com a criação de um plano mount do tecido. Em seguida, fazem quatro incisões igualmente espaçadas para além de criar quatro quadrantes, se proceder à parte 3 (enriquecimento da membrana de Bruch macular) não cortar através da região da mácula. Assegurar que as incisões estendem-se através de toda a profundidade do tecido ocular – a partir da retina neurosensorial mais interna (NSR), através da da coróide e esclera (branco do olho). Continuar a incisão todo o caminho volta do olho a partir da margem da ocular para o nervo óptico. Isto irá permitir que a ocular para ser achatado (ver Figura 1B). Segurando um quadrante da ocular achatada usando pinça A (para evitar a separação coróide), utilizar o maior pinça B para agarrar o RSN vítreo e subjacente e puxar este tecido para longe do epitélio pigmentado da retina (RPE), a partir da periferia, movendo-se em direcção ao centro da ocular aberto e, em seguida, para o lado oposto. Geralmente, mas não sempre, tanto vítreo e NSR separar como um. Use a scalpel para excisar qualquer NSR residual ancorado no disco óptico. Mais uma vez, enquanto se mantém um quadrante do tecido no local usando uma pinça, utilizar o raspador de células estéril para desalojar cuidadosamente a monocamada de EPR de toda a superfície interior da viseira. Estas células prontamente separar e pode ser visto aglomerados castanho-escuros como pigmentadas. Lavar com PBS para lavar delicadamente células RPE longe desalojado do ocular. Em seguida, use pinça A descascar delicadamente fora do sobreposto tecido vermelho escuro (compreendendo tanto a membrana de Bruch e coróide) de todos os 4 quadrantes oculares. Colocar o tecido excisado em um prato limpo. Usando a borda achatada de um raspador de células para manter o tecido extirpado no lugar, usar o segundo raspador para raspar suavemente o tecido. Vire o tecido e repetir, removendo o máximo de material possível excesso. Eventualmente, uma membrana translúcida permanecerá: é a membrana de Bruch grosseiramente enriquecido. O uso do microscópio de dissecação numa ampliação de 20X mínimo éessencial em auxiliar a remoção da coróide e enriquecimento da membrana de Bruch. Usando uma pipeta de Pasteur, brevemente enxaguado membrana de Bruch com água ultrapura para remover sangue e coróide residual antes de colocar a membrana para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Suspender a membrana de Bruch enriquecido em cerca de 1 ml de água ultrapura e vortex brevemente (aproximadamente 15 segundos) para ajudar a lise celular contaminante qualquer matéria (ver Figura 2). Centrifugar a amostra a 500 xg durante 30 seg para sedimentar a membrana e aspirar o sobrenadante. Nota: Os restantes membrana de Bruch enriquecido está agora pronto para a solubilização (como descrito na secção 2 abaixo) ou de armazenamento a -80 ° C para uso posterior. 2. A solubilização de membrana e Western Blot Análise da Whole Enriched Bruch Extracto de proteína de membrana de Bruch enriquecido por imersão do tecido em 500 ul 8 M urEA durante 6 h à TA, em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga (Figura 3A). Centrifugar as amostras solubilizadas a 10.000 xg durante 10 min para sedimentar qualquer matéria extracelular restante. Remover o sobrenadante e transferi-lo para 3500 da membrana de diálise de MWCO, em seguida, colocar a amostra em 1 L de PBS a diálise durante 16 horas a 4 ° C. Para cada amostra, adicionar 40 ul de pérolas de isolamento de proteínas, e rodar amostra / mistura de esferas (20 rpm num misturador rotativo) à TA durante 30 min. Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 5 min para sedimentar as pérolas. Remover o sobrenadante e solubilizar a proteína ligada a esferas em 30 ul de 2x tampão de carregamento de amostra (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% de SDS, 26,3% (w / v) de glicerol, 0,01% azul de bromofenol, 3% β-mercaptoetanol). Incubar as amostras a 100 ° C durante 10 min, e depois centrifugar a 10000 xg durante 5 min para sedimentar as restantes grânulos. Carrega-se o sobrenadante que contém as proteínas libertadas para um pré-molde SDS-gel página gradiente (ver lista de materiais) para separação das proteínas. Visualize bandas de proteínas separadas usando um protocolo de coloração comum, por exemplo, azul de Coomassie. Em breve, adicionar 20 ml de azul brilhante mancha (0,1% de azul brilhante (w / v), 50% de metanol, 10% de ácido acético glacial, 40% de água) para o gel, e incubar durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave . Descartar a solução de coloração e lavar o gel corado com água desionizada até que a coloração de fundo é suficientemente reduzida para permitir a visualização da banda de proteína manchada. Alternativamente, as bandas de proteína de transferência separados para nitrocelulose para análise de Western, como descrito a seguir. Transferência de bandas de proteínas separadas para membrana de nitrocelulose a 80 mA durante 2,5 horas utilizando um aparelho de transferência semi-seco, em tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 10% [v / v] metanol). Bloquear a membrana em 10 ml de PBS, 10% (w / v) de leite, e 0,02% (w / v) de BSA durante 16 h a 4 ° C antes de the adição dos anticorpos primários para a detecção de proteínas desejadas. Nota: A título de exemplo aqui, a Figura 3C mostra uma imunotransferência representante da membrana de Bruch solubilizado a partir de três dadores distintos sondadas para um regulador da cascata do complemento, o factor H como proteínas-1 (FHL-1). 3. O enriquecimento da membrana de Bruch Macular Siga os passos 1,1-1,3, como descrito anteriormente. Embora o RSN ainda está no local, localizar a coloração foveal amarelo que representa a região central mácula (ver Figura 4). Usando um estéril 6 milímetros biópsia, colocá-lo acima da região foveal e firmemente cortar para a mácula. Mantendo o punção para biópsia no lugar, fazer uma incisão separada com um bisturi a partir da borda da ocular para a borda da lâmina de biópsia por punção, e em seguida, usando pinça B, descascar o material circundante do olho para conseguir uma biópsia limpo. Usando pinça C, removao disco de 6 milímetros de tecido do soco e lugar na tampa limpo placa de Petri. Coloque a tampa uma placa de Petri e soco macular sob o microscópio de dissecação. Retire o disco NSR fina (para verificar a coloração amarela foveal para inferir a precisão da biópsia). Use um raspador de células esterilizado para remover suavemente as células RPE. Fixe o disco macular através da esclera usando as pontas de pinça A, e, lentamente, retire o coróide e complexa membrana de Bruch usando pinça C. Mais uma vez, use o raspador de células para remover coróide indesejada e matéria de sangue de membrana de Bruch. Colocar a membrana de Bruch macular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e suspender em 1 ml de água ultrapura. Vortex brevemente (cerca de 15 segundos) para ajudar a lisar qualquer matéria celular contaminante. Centrifugar a amostra a 500 xg durante 30 seg para sedimentar a membrana e aspirar o sobrenadante. Nota: A membrana de Bruch enriquecido isolado a partir da mácula pode agora ser utilizado para uma proteomicANÁLISE usando protocolos de digestão de preferência do usuário.