העשרה של ממברנה של ברוך מעיני אדם תורמות

רקמת העין אנושית הסכימה למטרות מחקר התקבלה מבנק מנצ'סטר רויאל בית החולים לעיניים העיניים לאחר הסרת הקרנית להשתלה. השימוש ברקמות אנושיות למחקר היה בהתאם לחוק אדם רקמות (2004) הנחיות, ובאישור ועדת אתיקה למחקר באוניברסיטה (אסמכתא 11,305). 1. העשרה של ממברנה של כל הפריטים ברוך נקה את סביבת העבודה מסביב ומתחת למיקרוסקופ לנתח עם חומר חיטוי 1% (V / V) ולאחר מכן לנגב עם 70% (V / V) אתנול. ודא הבאים ליד: אזמל חדש חד פעמי, שני מגרדי סטרילי תא (נפוצה בתרבית רקמה) ושלושה זוגות של פינצטה (מופיעים כאן כ, B, ו- C, ראה רשימת חומרים). מניחים את גלובוס עין לצלחת פטרי, חד פעמית, שמירה על המכסה לשימוש מאוחר יותר. באמצעות אזמל חד פעמי חדש, להסיר כל עצב ראייה שייר, שעלול להפריע ליצירת מו שטוחUNT של הרקמה. בשלב הבא, לעשות ארבעה חתכים באופן שווה במרווחים ליצור ארבעה רביעים, אם ימשיכו לחלק 3 (העשרה של הקרום של קולרים ברוך) לא לחתוך את אזור המקולה. ודא שהחתכים להאריך דרך כל העומק של רקמות העין – מרשתית נוירו הפנימית ביותר (NSR), דרך דמית העין ולובן עין (הלבן של העין). המשך החתך כל הדרך עגולה העיניים משולי עיינית לעצב הראייה. זה יאפשר עיינית שהשתטחה (ראה איור 1). מחזיק ברבע אחד של עיינית שטוחה באמצעות פינצטה (כדי למנוע ניתוק דמית העין), להשתמש בפינצטה B הגדול יותר לאחיזת NSR הזגוגית והבסיסי ולמשוך רקמה זו מאפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתחיל בפריפריה, נע לכיוון המרכז של עיינית פתחה ולאחר מכן לצד שכנגד. בדרך כלל, אבל לא תמיד הן הזגוגית וNSR לנתק כאחד. השתמש בscalpel לבלו כל NSR שייר עגן בדיסק האופטי. שוב, תוך החזקה ברבע אחד של רקמה במקום באמצעות פינצטה, להשתמש במגרד תא סטרילי כדי לסלק בעדינות monolayer הרשתית מהמשטח הפנימי השלם של עיינית. תאים אלה בקלות לנתק וניתן לראות גושים חומים-פיגמנט כהים. לשטוף עם PBS לשטוף בעדינות תאי הרשתית וחילצה מן עיינית. בשלב הבא, להשתמש בפינצטה כדי לקלף בעדינות את הרקמה שמעליה אדום הכהה (הכוללת גם הקרום של ברוך ודמה עין) מכל 4 הרביעים עין. הנח את הרקמה נכרת לתוך צלחת נקייה. שימוש בקצה המשוטח של מגרד תא אחד להחזיק את הרקמה נכרתה במקום, להשתמש במגרד השני כדי לגרד את הרקמה בעדינות. הפעל את הרקמה שוב ולחזור, הסרת כמה שיותר חומר עודף ככל האפשר. סופו של דבר, קרום שקוף יישאר: זה הוא הקרום של ברוך גס המועשר. השימוש במיקרוסקופ לנתח במינימום של הגדלת 20X הואחיוני בסיוע להסרת דמית העין וההעשרה של קרומו של ברוך. בעזרת פיפטה פסטר, לשטוף בקצרה קרום של ברוך עם מים ultrapure כדי להסיר דמית העין ודם שייר לפני הצבת הקרום לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. להשעות את הקרום המועשר של ברוך בכ 1 מיליליטר מים ultrapure ובקצרה מערבולת (כ -15 שניות) כדי לעזור lyse כל עניין סלולארי זיהום (ראה איור 2). צנטריפוגה המדגם XG ב 500 במשך 30 שניות לגלולת הקרום ולשאוב את supernatant. הערה: הקרום של ברוך המועשר שנותר עכשיו הוא מוכן לsolubilization (כפי שתואר בסעיף 2 להלן) או אחסון ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר. 2. solubilization של ניתוח ממברנה והמערבי כתם של כל הפריטים מועשר ברוך לחלץ חלבון מהקרום של ברוך מועשר על ידי טבילה ברקמת 500 μl 8 M urEA במשך 6 שעות ב RT ב 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge (איור 3 א). דגימות solubilized צנטריפוגה ב 10,000 XG במשך 10 דקות כדי גלולה כל עניין תאי שנותר. הסר את supernatant ולהעביר אותו ל3,500 קרום הדיאליזה דה MWCO, ואז למקם את מדגם בL 1 של PBS לdialyse במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס. עבור כל דגימה, להוסיף 40 μl של חרוזים בידוד חלבון, ולסובב מדגם / תערובת חרוז (20 סל"ד במערבל מסתובב) ב RT למשך 30 דקות. צנטריפוגה דגימות 10,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה חרוזים. הסר supernatant וsolubilize חלבון קשור לחרוזים בμl 30 2x מאגר טעינת מדגם (65.8 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS, 26.3% (w / v) גליצרול, bromophenol 0.01% כחולים, 3% β-mercaptoethanol). דגירה הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואז צנטריפוגות ב10,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה חרוזים שנותרו. טען את supernatant המכיל את החלבונים שפורסמו על טרומי SDS-ג'ל שיפוע דף (ראה רשימת חומרים) להפרדת חלבונים. דמיינו להקות חלבון מופרדות באמצעות פרוטוקול נפוץ צביעה, למשל, Coomassie כחול. בקיצור, להוסיף 20 מיליליטר של הכתם הכחול המבריק (0.1% כחולים מבריק (w / v), מתנול 50%, 10% חומצה אצטית קרחונית, 40% מים) לג'ל, ודגירה במשך 30 דקות ב RT עם תסיסה עדינה . מחק את הפתרון מכתים ולשטוף את הג'ל מוכתם במים ללא יונים עד מכתים רקע מצטמצם במידה מספקת כדי לאפשר הדמיה להקת חלבון מוכתם. לחלופין, העברה מופרדת להקות חלבון לnitrocellulose לניתוח מערבי, כפי שתתואר להלן. העברה מופרדת להקות חלבון על קרום nitrocellulose ב 80 מילי-אמפר לשעה 2.5 באמצעות מנגנון semidry העברה במאגר העברה (25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין, 10% [v / v] מתנול). חסום את הממברנה 10 מיליליטר PBS, 10% (w / v) חלב, ושל 0.02% (w / v) BSA במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס לפני הבנוסף דואר של הנוגדנים הראשוניים הרצויים לגילוי חלבון. הערה: כדוגמא כאן, איור 3 ג תערוכות immunoblot נציג של הקרום של ברוך solubilised משלושה תורמים נפרדים חקר לרגולטור של המפל המשלים, חלבון גורם כמו H-1 (FHL-1). 3. העשרה של ממברנה של קולרים ברוך בצע את הפעולות 1.1-1.3 כפי שתואר לעיל. בעוד NSR הוא עדיין במקום, לאתר את colouration foveal הצהוב שמייצג את אזור המקולה המרכזי (ראה איור 4). באמצעות אגרוף ביופסיה 6 מ"מ סטרילי, למקם אותו מעל אזור foveal ותקיפות חתך למקולה. שמירה על הביופסיה במקום, לעשות חתך נפרד עם אזמל מקצה עיינית לקצה להב ביופסיה, ולאחר מכן באמצעות פינצטה B, לקלף את חומר עין מסביב כדי להשיג ביופסיה נקייה. באמצעות C פינצטה, להסירדיסק 6 מ"מ של רקמה מהאגרוף והמקום על מכסה צלחת פטרי הנקי. מניחים את המכסה צלחת פטרי ואגרוף מקולרי תחת מיקרוסקופ לנתח. הוצא את תקליטור NSR הדק (לבדוק מכתים foveal צהוב להסיק דיוק של ביופסיה). השתמש מגרד תא סטרילי כדי להסיר בעדינות את תאי הרשתית. אבטח את הדיסק מקולרי באמצעות לובן העין באמצעות הטיפים של פינצטה, ולקלף לאט דמית העין ומורכבת הקרום של ברוך השתמשתי פינצטה ג שוב, להשתמש במגרד התא להסיר דמית העין לא רצויה ועניין דם מקרומו של ברוך. מקום הקרום של הקולרים ברוך לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהשעות במי ultrapure 1 מיליליטר. בקצרה וורטקס (כ -15 שניות) כדי לעזור lyse כל עניין סלולארי זיהום. צנטריפוגה המדגם XG ב 500 במשך 30 שניות לגלולת הקרום ולשאוב את supernatant. הערה: הקרום של ברוך המועשר המבודדים מהמקולה כעת ניתן להשתמש לproteomicalysis באמצעות פרוטוקולי העיכול המועדפים של המשתמש.