Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.
Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.
המחקר של פתוגנים מסתמך על מערכות מודל הולמות לחקות את זיהום in vivo. לכמה סוכנים מזהמים, מערכות מודל הולמות חסרות בעוד שחלק מהמערכות המשמשות הן רחוקות מלהיות אופטימלי. דוגמא אחת היא החיידק הליקובקטר פילורי בקיבה (הליקובקטר פילורי), אשר קשור בקשר סיבתי להתפתחות סרטן קיבה. עם זאת, בהיעדר מערכת תרבית תאים מתאימה יותר, מחקרים רבים שהמטרה לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס שורות תאי סרטן שימוש התפתחות הסרטן, המייצגים את נקודת הקצה של המפל הסרטני. תאים ראשוניים, שאינם-שינה יהיו מודל טוב יותר ללימודים אלה. עם זאת, תאים ראשוניים זמינים רק ממספר קטן של תורמים ולא יכולים להיות מתורבת על פני תקופות זמן ארוכות יותר. בשנים האחרונות, מחקר בתאי גזע יש התקדמות משמעותית כדי לספק מקורות חדשים לתרביות תאים ראשוניות לחקר הביולוגיה זיהום.
תרבויות משלושה מקורות תאי גזע שימשו: תאי גזע עובריים (ESC), תאי מושרה pluripotent גזע (iPSC) או בתאי גזע בוגרים. הם היו בשימוש מודל זיהומים בוירוסים, כגון וירוס ציטומגלווירוס 1,2 או הפטיטיס C 3 – 7, טפילים, כגון falciparum Plasmodium 8 או Toxoplasma gondii 9, וחיידקים, כגון Bacterioides thetaiotaomicron 10 או 11 enterica סלמונלה. לאחרונה, כמה גישות פורסמו מודל זיהום עם ה ' פילורי עם organoids שמקורם בתאי iPS ESC או 12, בתאי גזע בוגרים עכבר 21,22 או אדם בתאי גזע בוגרים 13-15.
הפיתוח של תרבויות organoid מתאי גזע בוגרים שמקורם מחקר, שבו תאי גזע בודדים המבודדים מאפיתל במעי עכברי היו זרע לתוך מטריצת 3 ממדים ומשובץ במדיום שחיקה את הסביבה של תאי גזע במעי המכילים EGF כmitogen, R-spondin כדי לשפר איתות Wnt ובחור! לעכב חלבון מורפוגני העצם (BMP) איתות 16. יש לציין תרבויות אלה אינן דורשות שיתוף תרבות עם תאי mesenchymal. בתנאים אלה, תאי הגזע להתרבות וליצור מבנים קטנים עם תחומים מחסה תאים של מאורות מעיים, ותחומים המכילים את התאים של סיסי מעיים. Organoids כך עצמי לארגן לחקות את המצב בvivo. היום, ניתן לגדל תאי גזע בוגרים מרבים עכברי ורקמות אנושיות במבחנה ועצמית לארגן לorganoids דומה לעמיתם in vivo, כגון מעי דק ומעי גס 17, בטן 13,18, כבד 19,20, לבלב 21 ו ערמונית 22.
כאן אנו מספקים וידאו פרוטוקול לעכבר תרבות או organoids קיבה אנושי מcel גזע בוגריםls וmicroinject עם ה ' פילורי. פרוטוקול זה מבוסס על דיווחים קודמים 13,18. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לculturing ומדביק תרבויות organoid אחרות כגון organoids מעיים.
This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations.
Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the adva…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) to S.B. and a Research Prize from the United European Gastroenterology Foundation to H.C. We would like to thank Harry Begthel, Jeroen Korving and the Hubrecht Imaging Center for technical assistance, Meritxell Huch for help with initial organoid culture and Yana Zavros for discussion.
Medium | |||
HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
Matrigel, GFR, phenol free | BD | 356231 | |
GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | Stock concentration 50 x, final concentration 1x |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
Murine recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
Human recombinant FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/mL, final concentration 200 ng/mL |
TGFβi A-83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
[Leu15]-Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM |
RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Wnt3A conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
R-spondin1 conditioned medium | Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford. | ||
Noggin conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
R-spondin3 | R&D | 3500-RS/CF | Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/mL), but not yet on gastric organoids. |
Noggin | Peprotech | 120-10 | Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/mL), but not yet on gastric organoids. |
TrypLE express | Life Technologies | 12605036 | Enzymatic dissociation solution |
CoolCell® Alcohol-Free Cell Freezing Containers | biocision | BCS-405 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648-010 | |
Antibiotics | |||
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none. |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Stock concentration 10000/10000 U/mL, final concentration 100/100 U/mL. Can be used alternatively to Primocin in long term culture. |
Otro | |||
Tweezers | Neolabs | 2-1033 | Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue. |
4 Well Multidishes | Thermo Scientific | 144444 | You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator. |
Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
Microinjector | Narishige | IM-5B | |
Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
Workbench | Clean Air | Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition | |
Cappillaries | Harvard Apparatus | GC100T-10 | 1 mm outer diameter, 0,78 mm inner diameter. |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | Flaming Brown Micropipette Puller | |
anti Cag A antibody | Santa Cruz | sc-25766 |