Optogenetische Functional MRI

Ethik-Statement: Experimentelle Verfahren hier wurden von der Stanford University Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt. 1. Vorbereiten Patchkabel und Zwinge Implantate Hinweis: Obwohl Patchkabel und Zwinge Implantate im Handel erhältlich sind, produzieren diese in-house Spezialität Designs ermöglicht und weniger kosten. einen Faserverbindungskabel zum Zuführen von Licht von dem Laser auf das Implantat im Gehirn, spalten zuerst die optische Faser auf die gewünschte Länge herzustellen. Unter Verwendung eines Faser-Spalter, beenden die optische Faser ein flaches Ende am Anschlusspunkt zu erzeugen. Wenn die Faser mit einem Mantel überzogen ist, abzustreifen die Jacke vorher mit einem faser Abisolierwerkzeug aus. Abzuspalten das andere Ende der optischen Faser um die gewünschte Länge für das Kabel zu erzeugen, so dass das Kabel von der Lichtquelle an das Tier innerhalb der Bohrung zu erstrecken lang genug ist,der Scanner. Mischen, um eine kleine Menge an Epoxy-Klebstoff in einer 1: 1-Verhältnis auf ein Stück Aluminiumfolie kurz vor dem nächsten Schritt, wie die Epoxy-Kleber für die Verwendung nach dem Mischen 5 min zu viskos wird. Mit einem kleinen Holzstäbchen vorsichtig Epoxid-Kleber auf den Teil der Faser gelten, die innerhalb der konkaven Seite der Keramikring platziert werden und gelten dann einen kleinen Tropfen auf die Oberfläche der flachen Seite des Ringes. Nachdem es in die Zwinge Einsetzen sicherzustellen, daß eine kleine Länge der Faser (<0,5 mm) von der Flachseite der Keramikhülse vorsteht. Lassen Sie den Epoxid-Kleber O / N, um optimale Ergebnisse zu härten. Auf der Seite des LWL-Patchkabel, das mit der Laserlichtquelle verbinden wird, sanft Epoxid-Kleber auf den Teil der Faser, die in der konkaven Seite der Zwinge des FC / PC-Anschluss platziert wird und dann geben Sie eine kleine Anwendung fallen auf die Oberfläche der flachen Seite der Ferrule. Nachdem es in die Zwinge Einsetzen sicherzustellendaß eine kleine Länge der Faser (<0,5 mm) ragt von der flachen Seite des Ringes. Lassen Sie den Epoxid-Kleber O / N, um optimale Ergebnisse zu härten. Polieren Sie das flache Ende der Ferrulen für beide Seiten des Kabels mit einer Polierscheibe mit von Pinzette mit sanften Druck auf die Hülse aufzubringen, während machen Figur-8 Drehungen auf Aluminiumoxid Läppen Blätter (von 3 & mgr; m bis 1 & mgr; m bis 0,3 & mgr; m Körnung ). Untersuchen Sie das flache Ende der Hülse mit einem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des flachen Ende, einschließlich der LWL-Oberfläche selbst, frei von jeglicher Epoxid-Kleber ist; weiter Polieren wenn Epoxid-Kleber auf der Oberfläche bleibt. Stellen Sie sicher, dass die faseroptische Oberfläche nicht gebrochen oder gesäumt wurde. ACHTUNG: Stellen Sie sicher, Personal geeignete Klassen Training Lasersicherheit und Laserschutzbrille tragen, bevor Laser-Geräte Handhabung. Schließen Sie das LWL-Patchkabel mit dem Laserlichtquelle durch den FC / PC-Anschluss und richten Sie die fiber Spitze auf den Brennpunkt des Kopplers. Messen Sie die Lichtübertragungsleistung der Faser mit einem Leistungsmesser, um eine angemessene Lichtleistung zu gewährleisten. Hinweis: Die folgenden Schritte zur Herstellung von Keramikringen mit Faseroptik für chronische Implantation in das Gehirn sind; Keramikringe sind hohl in der Mitte und tragen Glasfaser Licht, das von einem Patch-Kabel zu einer Region von Interesse (ROI) innerhalb des Gehirns zu liefern. Unter Verwendung eines Faser-Spalter, beenden die optische Faser ein flaches Ende am Anschlusspunkt zu erzeugen. Wenn die Faser mit einem Mantel überzogen ist, abzustreifen die Jacke vorher mit einem faser Abisolierwerkzeug aus. Abzuspalten das andere Ende der optischen Faser um die gewünschte Länge zur Implantation in das Gehirn zu erzeugen. Bestimmen die Länge der Faser einen stereotaktischen Atlas unter Verwendung der ROI innerhalb des Gehirns zu zielen. Zum Beispiel: dorsalen Hippocampus in rat Ziel, die 3,5 mm unterhalb Bregma ist, sicherzustellen, dass die Länge der Faser vom ferrul abstehendene beträgt 3,5 mm + 0,25 mm, einem Anteil von Schädeldicke und damit für Fehlermarge. Prüfen Sie daher, dass die endgültige Länge der Faser 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (Länge der Zwinge) = 14,25 mm. Mischen, um eine kleine Menge an Epoxy-Klebstoff in einer 1: 1-Verhältnis auf ein Stück Aluminiumfolie kurz vor dem nächsten Schritt (den Epoxykleber zu viskos zur Verwendung 5 min nach dem Mischen). Mit einem kleinen Holzstäbchen vorsichtig Epoxid-Kleber auf den Teil der Faser gelten, die innerhalb der konkaven Seite der Keramikring platziert werden und gelten dann einen kleinen Tropfen auf die Oberfläche der flachen Seite des Ringes. Nachdem es in die Zwinge Einsetzen sicherzustellen, daß eine kleine Länge der Faser (<0,5 mm) von der Flachseite der Keramikhülse vorsteht. Lassen Sie den Epoxid-Kleber O / N, um optimale Ergebnisse zu härten. Polieren Sie das flache Ende der Zwinge eine Polierscheibe mit von Pinzette mit sanften Druck auf die Hülse aufzubringen, während machen Figur-8-Rotations auf Aluminiumoxid Läppen Blätter (3 & mgr; m bis 1 & mgr; m bis 0,3 & mgr; m grit). Untersuchen Sie das flache Ende der Hülse mit einem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des flachen Ende, einschließlich der LWL-Oberfläche selbst, frei von jeglicher Epoxid-Kleber ist; weiter Polieren wenn Epoxid-Kleber auf der Oberfläche bleibt. Stellen Sie sicher, dass die faseroptische Oberfläche nicht gebrochen oder gesäumt wurde. Paar die polierte Zwinge mit einem Glasfaser-Patchkabel mit einer Zwinge Hülse und schließen Sie das Patchkabel an einer Laserlichtquelle. Messen Sie die Lichtübertragungsleistung an der Spitze der Faser mit einem Leistungsmesser, um eine angemessene Effizienz gewährleisten. Ein Protokoll der Leistungsabgabe von der Zwinge Patch erforderlichen Kabel für jede Ferrule Implantat zur Ausgabe der gewünschte Leistungspegel an der Spitze der Faseroptik (2,5 mW in diesem Protokoll). Verwerfen Ferrulen mit einer Dämpfungsrate von über 50% und mit nicht kreisförmigen Ausgabemuster. 2. Stereotaktische Implantation Chirurgie und Virus Injection Stellen Sie sicher, dass alle experimentellen Verfahren die Verwendung von Tieren beinhalten, die von der lokalen IACUC zugelassen sind. Pflegen aseptischen Bedingungen während Überleben Operationen durch aseptische Verfahren folgen, einschließlich der Verwendung von sterilen Handschuhen, sterile Masken, sterile OP-Abdeckungen und sterilisierten chirurgischen Instrumenten. VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Chirurgen Persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Schutzbrille tragen vor Beginn des Verfahrens. Befolgen Sie die Anweisungen Standard Biosicherheit, wenn sie mit Adeno-assoziierter Vektor (AAV) arbeitet, kümmert sich um Spritzer zu vermeiden. Entsorgen Sie AAV Abfall in einem Behälter für biologischen. Legen Sie eine Mikroliterspritze mit genügend AAV zur Injektion in das Tier plus extra zu berücksichtigen mögliche Volumenverluste (insgesamt 4 ul pro Tier), halten Sie die Spritze auf dem Eis vor dem Gebrauch. In diesem Protokoll AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP bei einem Titer von 4×10 12 vg / ml verwendet. Legen Sie das Tier unter Isoflurane Anästhesie mit einer Induktionskammer, verbunden mit einer Genauigkeit Isofluran Verdampfer Satz mit einem 3 – 4% mit einem Sauerstoffgasquelle. Rasur den Kopf mit einem elektrischen Rasierer und führen Sie eine dreifache chirurgische Peeling auf der Haut mit Betadin und 70% Ethanol spülen. Sobald das Tier in tiefer Narkose (prüfen Zehenreflex und Atemfrequenz) ist, zu immobilisieren den Schädel des Tieres in einem stereotaktischen Apparat mit intra-aural Positionierung Nieten und Zahnstange. Hinweis: Die gesamte Prozedur 1 nehmen – 2 Stunden, von Narkoseeinleitung zur Genesung. Stellen Sie die Anästhesie auf ein angemessenes Niveau (1 – 3% Isofluran auf dem Verdampfer) und kontinuierlich zu überwachen die Vitalfunktionen des Tieres, die Anpassung der Anästhesie als notwendig, eine Atemfrequenz von ~ 40 Atemzüge / min zu halten. Verabreichen Augensalbe auf die Augen des Tieres Trockenheit zu verhindern, während sie unter Anästhesie. Machen Sie einen 15 bis 20 mm Mittellinie Kopfhaut Schnitt mit einem Skalpell und einfahren, die Kopfhaut mit chirurgischen hemostats einmit dem Periost ttached. Referenz Lambda und Bregma die Bohrkrone über die Koordinaten für den ROI zu positionieren. Bohren Sie ein kleines Kraniotomie (2 – 3 mm) über den ROI mit einem Zahnbohrer, kümmert sich nicht um das Gehirn zu durchstechen. Langsam Nadel auf die Mikroliterspritze durch die Kraniotomie an den ROI im Gehirn angebracht einfügen. Mit einer Mikropumpensteuerung, injizieren 2 ul der Vektor-Lösung in den ROI. Verwenden, um eine Durchflussrate von 150 nl / min Gewebeschäden zu vermeiden. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, wartet 10 min, bevor die Spritze langsam mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mm / min zu entfernen. Nach der Injektion trocken die Oberfläche des Schädels. Referenz lambda Bregma und Koordinaten zu bestätigen und dann die Ferrule Implantates an das Zieltiefe einsetzen (zum Beispiel: 3,5 mm unter Bregma für dorsalen Hippocampus) mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 mm / min. Montieren Sie die Zwinge Implantat auf den Schädel mit Zahnzement. Nachdem der Zahnzement verfestigt hat, dichten den Einschnitt mit Nähten (size 5-0 für Ratten) um den Zahnzement Kappe. Nach der Operation, legen Sie das Tier in seinem Käfig einzeln mit der Hälfte des Käfigs auf einer Heizung für Anästhesie Erholung untergebracht. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Stellen Sie das Tier nicht in der Gesellschaft anderer Tiere, bis sie vollständig erholt hat. Für postoperative Behandlung von Schmerzen, verabreichen Buprenorphin subkutan alle 12 Stunden bei einer Dosis von 0,05 mg / kg für 24 Stunden. Verabreichen Antibiotika-Pulver täglich über der Einschnittstelle für 3 Tage. Entfernen der Nähte etwa zwei Wochen nach der Operation Schorfbildung zu verhindern. Warten Sie 4 – 6 Wochen nach der Virusinjektion für eine ausreichende Expression von optogenetische Gene vor Durchführung von Experimenten. 3. optogenetische Functional MRI ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig, um das permanente Magnetfeld eines Magnetresonanztomographen. Sichere equipmhno, einschließlich der Funktion, Lichtquelle, Ventilator, capnograph und Gastanks, ausreichend weit weg (zumindest jenseits der 5 Gauss Grenze) Generator. Legen Sie das Tier unter Gasnarkose mit einer Induktionskammer, verbunden mit einer Genauigkeit Isofluran Verdampfer Satz bei 5% mit einem Sauerstoffgasquelle. Sobald das Tier in tiefer Narkose (Kontroll toe reflex und Atemfrequenz) ist, intubieren das Tier nach dem Protokoll in Rivard detailliert et al. (2006) die Überwachung der Kohlendioxid 26 durch Kapnografie zu ermöglichen. Hinweis: Intubation ist von entscheidender Bedeutung in der richtigen Ebenen der exspiratorische CO 2 während der Bildgebung zu halten. Sichern Sie das Tier in den Scanner Wiege. Hinweis: In diesem Protokoll wurde die Wiege benutzerdefinierte produziert, aber solche Wiegen sind auch im Handel erhältlich. Die Ratte Wiege Funktionen das Tier innerhalb des Scanners für die Lieferung der Anästhesie zu sichern, erwärmte Luft und zur Einschränkung der Bewegung. Liefern Sie eine Mischung aus Isofluran (Ranging 1,2 bis 1,5%) in etwa 60% Stickstoffoxid und 40% Sauerstoff über einen Schlauch durch die Docking-Station. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres sicher, um Bewegungsartefakte zu vermeiden, festgelegt ist. Geben Sie erwärmte Luft durch den Schlauch in die Docking-Station und fügen Sie ein Rektalthermometers mit Schmierstoff Körpertemperatur zu überwachen. Verabreichen Augensalbe auf die Augen des Tieres Trockenheit zu verhindern, während sie unter Anästhesie. Schließen Sie das LWL-Patchkabel an einer Laserlichtquelle und messen Sie den Ausgang an der Spitze der Zwinge des Patchkabel mit einem Leistungsmesser. Einzustellen, um den entsprechenden Leistungspegel (bestimmt zuvor in Schritt 1.15) die gewünschte Ausgangs (2,5 mW in diesem Protokoll) an der Spitze der Faseroptik innerhalb des Gehirns implantiert zu erzeugen. Da übermäßige Leistung aus dem faseroptischen potentiell Gewebeschäden im Gehirn verursachen kann oder Gewebeerwärmung verursachen, die Signal-Artefakte erzeugen wird, nicht wesentlich erhöht die Leistung des Lasersüber die vorgesehene Ausgabe. Verhindern Lichtleckage von dem Implantat mit einem Konus von schwarzem Isolierband und decken die Augen des Tieres. Paar das Glasfaserkabel an die Zwinge Implantat auf das Tier mit einer Ferrule Hülse. Setzen Sie die Spule über den Kopf des Tieres. Legen Sie die Wiege mit Tier in die Bohrung des Scanners. Hinweis: In diesem Protokoll wird die Single-Loop-Sende-Empfangsspule wurde speziell hergestellt und vorge abgestimmt, um die optimale Funkfrequenz von Hirngewebe zu erhalten. Überwachen Sie die Atemfrequenz und Körpertemperatur während des gesamten Prozesses, die Anpassung der Beatmungsgerät und Heizung nach Bedarf auf physiologische Werte in Grenzen halten (sicherzustellen , dass exspiratorische CO 2 ist 3 bis 4% durch Drehen der Knöpfe auf dem Beatmungsgerät Hubfrequenz und Lautstärke einzustellen , und dass Temperatur ist 37 ° C durch die Pfeile für die Temperatureinstellung klicken). Wählen Sie eine Positionierung Sequenz Bild der Tierkopfposition. Wenn die bregen ist an der Iso-Zentrum nicht, das Tier Kopfposition einstellen und die Positionierung Scan wiederholen, bis das Gehirn an der Iso-Zentrum ist. Wählen Sie eine lineare Shim-Sequenz und klicken Sie auf Last in der Sequenz-Auswahlfenster. Als nächstes klicken Sie auf Inhomogenitäten des Magnetfeldes zu reduzieren beginnen. Hinweis: Unterlegbleche ein wichtiger Schritt ist, die direkt um die Integrität der fMRI-Daten beeinflussen. Wählen Sie einen T2-gewichteten Sequenz und klicken Sie auf Last in der Sequenz-Auswahlfenster. Als nächstes klicken Sie auf Start T2-gewichteten hochauflösende koronalen anatomische Bilder vor dem fMRI zu erwerben auf die allgemeine Integrität des Gehirns zu überprüfen und die Lage der optischen Faser Implantat zu bestätigen. Hinweis: Diese Bilder können als Anatomie-Overlays für die ofMRI Scan-Serie verwendet werden. Verbinden BNC-Kabel von der Auslöseöffnung des MRI-Scanner an den Funktionsgenerator, so dass die Laserlichtquelle entsprechend einer experimentellen Stimulation Paradigma angetrieben wird. Hinweis: In diesem Protokoll wird die Stimulation pAradigm 30 sec von Baseline um 20 Sekunden, gefolgt auf / 40 sec für sechs Minuten ab. Wählen Sie ein Multi-Slice-Gradienten-Echo (GRE) Sequenz aufgerufen und klicken Sie auf Last in der Sequenz-Auswahlfenster. Als nächstes klicken Sie auf Start 35 mm x 35 mm (2D FOV) in der gleichen Ebene mit 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm räumliche Auflösung koronalen Scheiben zu erwerben. Hinweis: Die hier verwendete GRE-Sequenz hat eine Wiederholungszeit (TR) und Echozeit (TE) von TR / TE = 750/12 ms und 30 ° Kippwinkel. Am Ende des Scans, entfernen Sie das Tier aus dem Scanner und zu überwachen, bis er aus der Narkose erwacht und kann Brustlage halten. 4. ofMRI Datenanalyse Hinweis: Die folgenden Schritte durchgeführt werden in MATLAB als in einer Publikation auf hohem Durchsatz ofMRI 27 beschrieben. Nachdem der rohen Abtastdaten an den Computer für die Analyse verwendet übertragen wurde, verwenden Gleitfenster Rekonstruktion des Bildes jedes TR zu aktualisieren, mitein Vier-Verschachtelungs-Spiral-Anzeige, 750 ms TR und 12 ms Echozeit 23 Scheiben pro Scan Serie zu erwerben. Statt herkömmlicher Rekonstruktion , wo neue fMRI Bilder nur rekonstruiert werden , nachdem alle Verschachtelungen für jede Scheibe erworben werden, rekonstruiert das Schiebefenster Rekonstruktionsverfahren Bilder nach dem Erwerb von jeweils interleaf 27. Verarbeiten Sie die Rohdaten für die zweidimensionale Rasterung Rekonstruktion, Bewegungskorrektur und die Berechnung der Zeitreihe als zuvor 27 beschrieben. Verwenden eines Schwellenkohärenzmethode aktiviert Voxel bestimmen , indem die prozentuale Modulation des BOLD Signal jedes Voxel relativ zu der Basisperiode gesammelt vor der Stimulation der Berechnung wie zuvor beschrieben 27. Berechnen Kohärenzwerte als die Größe der Fourier bei der Frequenz der wiederholten Stimulationszyklen durch die Summe der Quadrate aller Frequenzkomponenten 8 geteilt wandeln. Unter Verwendung der Zeitreihendaten für jedes vOxel, mittlere Bewegungskorrigierten Bilder, die gehören zu aufeinanderfolgenden Abtastungen des gleichen Stimulations Paradigma zuerst. Dann auszurichten , um die durchschnittlichen 4D – Bilder zu einem gemeinsamen Koordinatenrahmen mit einem Sechs – Grad-of-freedom Starrkörpertransformation sowie isotropen Skalierung zum Vergleich innerhalb und zwischen den Tieren , wie zuvor beschrieben 27.