光遗传学功能磁共振成像

伦理学声明：实验步骤这里已经批准了斯坦福大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）。 1.准备跳线和套圈植入注意：尽管接插电缆和套圈植入物是市售的，生产这些内部使专门设计和将花费更少。 用于在大脑从激光传送光到植入物制成纤维跳线，第一切割光纤到所需的长度。 用光纤切割刀，终止该光纤，以产生在终端点的扁平端。如果纤维已经涂有一外套，剥去护套了与预先纤维剥离工具。 切割光纤以产生用于电缆的所需长度的另一端，确保电缆足够长以从光源延伸到动物的孔内扫描仪。 下一步前不久1比射到一块铝箔，作为环氧胶变混合后太粘使用5分钟：混合于1环氧胶少量。 用一个小木棍，环氧树脂胶轻轻涂抹到将被放置在陶瓷插芯的凹侧内，然后申请一小滴上套圈的侧平的表面纤维的一部分。将其插入套箍以后，保证光纤（<0.5mm）的小长度从陶瓷套圈的平面侧突出。允许环氧树脂胶硬化O / N以获得最佳效果。 在光纤跳线的侧将连接到激光光源，轻轻环氧树脂胶适用于将被放置在FC / PC连接器的套圈的凹侧内的纤维的部分，然后应用一个小拖放到套圈的平面侧的表面。将其插入套箍以后，确保该纤维（<0.5mm）的小长度从套圈的平坦侧突出。允许环氧树脂胶硬化O / N以获得最佳效果。 通过使用镊子应用上套圈平缓向下的压力抛光套圈用于使用研磨盘的电缆两侧的平坦端，而从3微米至1微米至0.3微米的粒度使得在氧化铝上研磨板（图8转）。 检查用放大100倍的显微镜套圈的平板终端。确保该平端，包括光纤表面本身的表面上，是自由的任何环氧树脂胶;继续研磨如果环氧树脂胶留在表面上。确保光纤表面没有破裂或碎裂。 注意：确保人员采取适当的激光安全培训课程和操作激光设备前穿激光防护镜。 光纤跳线通过FC / PC连接器连接到激光光源和调整的FIBER尖耦合器的焦点。测量用功率计的光纤的光传输功率，以保证有足够的光输出。 注：以下步骤是制备陶瓷插芯与光纤慢性植入到大脑;陶瓷套圈是在中心中空和携带光纤到大脑内的贴片电缆传送光到感兴趣区域（ROI）的区域。 用光纤切割刀，终止该光纤，以产生在终端点的扁平端。如果纤维已经涂有一外套，剥去护套了与预先纤维剥离工具。 切割光纤的另一端，以产生用于植入所需的长度进入大脑。使用立体定向图谱定位大脑内的ROI确定光纤的长度。 例如：目标背侧海马在大鼠，低于前囟3.5微米，确保从ferrul突出的纤维长度Ë为3.5mm +0.25毫米，占颅骨厚度允许的误差幅度。因此，检查纤维的最终长度为3.5mm +0.25毫米10.5毫米（套圈的长度）=14.25毫米。 混合，在1环氧树脂胶少量：下一步前不久1比射到一块铝箔（环氧胶混合后成为使用5分钟太粘）。 用一个小木棍，环氧树脂胶轻轻涂抹到将被放置在陶瓷插芯的凹侧内，然后申请一小滴上套圈的侧平的表面纤维的一部分。将其插入套箍以后，保证光纤（<0.5mm）的小长度从陶瓷套圈的平面侧突出。允许环氧树脂胶硬化O / N以获得最佳效果。 用抛光盘用的镊子适用于套圈温和的下行压力，同时使8字形旋转抛光套圈的平端S于氧化铝研磨片（从3微米至1微米至0.3微米的粒度）。 检查用放大100倍的显微镜套圈的平板终端。确保该平端，包括光纤表面本身的表面上，是自由的任何环氧树脂胶;继续研磨如果环氧树脂胶留在表面上。确保光纤表面没有破裂或碎裂。 耦合抛光套圈与套圈套筒光纤跳线和贴片电缆连接到一个激光光源。测量在用功率计的光纤的前端的光发射功率，以保证有足够的工作效率。 保持一个记录从贴片电缆的套圈要求每个套圈植入到输出在光纤（2.5毫瓦在这个协议）的前端的所需功率电平的功率输出。丢弃套圈具有超过50％的衰减率，并具有非圆形的输出图案。 2.立体定位小鬼lantation手术和注射病毒确保涉及使用动物的任何实验程序由本地IACUC批准。按照无菌程序，包括使用无菌手套，无菌口罩，无菌手术巾和消毒的手术器械维持在生存手术无菌条件。 注意：确保医生都穿着适当的个人防护装备（PPE），包括在开始操作之前，安全护目镜。与腺相关载体（AAV）时，注意避免飞溅遵循标准的生物安全程序。 AAV的垃圾在生物危害容器中进行处理。 加载具有足够的AAV微升注射器注射到动物加额外考虑到潜在的体积损失（总每只动物4微升），保持注射器在冰上使用前。在这个协议中，用于在4×10 12 VG / ml的滴度AAV5-CaMKIIa-hChR2（H134R）-EYFP。将异氟醚下的动物È麻醉用感应室，连接到一个精密的异氟烷蒸发器组在3 – 4％与氧气源。 用电动剃须刀刮胡子的头部和使用聚维酮碘和70％乙醇冲洗皮肤进行手术三倍擦洗。 一旦动物在深麻醉（趾检查反射和呼吸频率），固定动物的头骨与内部听觉定位螺栓和齿杆立体定位仪。 注：整个过程将需要1 – 2小时，从麻醉诱导恢复。 设置麻醉到适当的水平（1 – 在蒸发器3％异氟烷），并持续监控动物的生命体征，调整麻醉必要时保持40次呼吸/分钟的〜呼吸速率。管理上的动物的眼睛的眼用软膏，以防止干燥时在麻醉下。 使15 – 20毫米中线切开头皮用解剖刀并使用外科止血缩回头皮ttached至骨膜。参考Lambda和前囟门钻头定位在对投资回报率的坐标。 钻一个小的开颅手术 – 在用牙钻的投资回报率（2 3毫米），，注意不要刺破大脑。慢慢插入通过开颅附着到微升注射器在大脑中的ROI针。 用微量泵控制器，注入2微升载体溶液进入投资回报率。使用150升/分钟的流速，以避免组织损伤。注射完成后，慢慢地去除注射器，以0.5mm / min的速度之前等待10分钟。 注射之后，擦干头骨表面。参考拉姆达和前囟，以确认坐标，然后插入套圈植入到目标深度（例如：3.5毫米以下囟为背侧海马）在约0.5毫米/分钟的速率。安装套管植入物用牙科水泥颅骨。牙科水泥凝固后，密封缝合切口（SI泽5-0老鼠）周围的牙齿水泥盖。 手术后，将它在笼中单独圈养，对麻醉复苏加热器的顶笼一半的动物。无人看管，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧不要让动物。不要将动物在该公司其他动物的，直到它已完全恢复。 对于手术后的疼痛管理，辖丁丙诺啡皮下注射0.05毫克/千克24小时的剂量，每12小时。每日施用抗生素粉末在切口部位3天。 手术后两周左右取出缝合线，以防止结痂。 等待4 – 6周病毒注射光遗传学基因的表达足够进行实验前了。 3.光遗传学功能磁共振成像注意：锻炼围绕核磁共振成像扫描仪的永久磁场谨慎。安全设备，用品耳鼻喉科，包括函数发生器，光源，呼吸机，二氧化碳监测仪和气体罐，足够远（至少超过5高斯限制）。 放置气体麻醉下的动物用感应室，连接到一个精密的异氟烷蒸发器组在5％与氧气源。 一旦动物是在深度麻醉（检查趾反射和呼吸速率），根据在里瓦德等人详细描述的协议插管动物。（2006）由二氧化碳图26，以允许二氧化碳的监控。注：插管在成像过程中保持呼气的 CO 2的正常水平是至关重要的。 确保动物在扫描仪摇篮。 注意：在这个协议中，托架被定制生产，但这样的支架也可商购。大鼠摇篮功能，以确保扫描仪内的动物交付麻醉，热空气和运动的限制。 递送异氟烷的混合（rangin得自1.2 – 1.5％）的大约60％的一氧化二氮和40％的氧气通过管道通过的摇篮。确保动物的头被牢固地固定，以避免运动伪影。 通过在支架管提供热空气，并插入直肠温度计润滑剂监测体温。管理上的动物的眼睛的眼用软膏，以防止干燥时在麻醉下。 光纤跳线连接到激光光源并测量接线电缆的套圈用功率计尖端的输出。 调整到适当的功率电平（在步骤1.15预先确定的），以产生在大脑内植入光导纤维的前端所需的输出（2.5毫瓦在此协议）。由于从光纤输出过大的功率可能会导致大脑内部组织损伤或引起，这将产生信号假象组织加热，不显著加大激光的功率输出超出预期的输出。 从黑电带的锥形植入物防止漏光并覆盖该动物的眼睛。耦合光缆上有一箍套筒动物套圈植入物。 放置线圈在动物的头。将动物摇篮到扫描仪的孔。 注意：在这个协议中，单环发送 – 接收线圈被定制生产和预调谐以接收从脑组织的最佳无线电频率。 监控呼吸率和体温在此过程中，调整作为必要保持限度内生理值的人工换气装置和加热器（确保呼气的 CO 2是3 – 4％通过旋转上呼吸机的旋钮调节冲程频率和音量，并且温度是通过点击用于温度设定的箭头）37℃。 选择一个定位序列图像动物头位置。如果将b雨不是在等中心，调节动物头位置，然后重复所述定位扫描直到大脑在等中心。选择线性匀场序列和点击的顺序选择窗口负荷。接下来，单击开始减少磁场的不均匀性。 注：匀场是会直接影响功能磁共振成像数据的完整性的关键一步。 选择T2加权序列和点击的顺序选择窗口负荷。接下来，单击开始之前，fMRI来获得T2加权高分辨率日冕解剖图像检查对大脑的整体完整性，并确认光纤植入的位置。 注意：这些图像可以被用作解剖覆盖了ofMRI扫描系列。 从MRI扫描仪的触发端口连接BNC电缆给函数发生器，使激光光源根据一个实验刺激范式驱动。 注：在这个协议中，刺激paradigm是30秒基线其次是20秒开/ 40秒关六分钟。 选择多层梯度回波（GRE）序列，并单击顺序选择窗口负荷。接下来，单击开始收购平面35毫米×35毫米（2D FOV）冠状切片用0.5毫米×0.5毫米×0.5 MM空间分辨率。 注意：这里使用的GRE序列具有TR / TE的重复时间（TR）和回波时间（TE）=毫秒750/12和30°翻转角度。 在扫描结束时，从扫描仪中删除的动物和监视，直到它已经从麻醉觉醒并能维持胸骨斜卧。 4. ofMRI数据分析注意：如在高通量ofMRI 27的出版物描述在MATLAB执行以下步骤。 原始扫描数据已传输到用于分析的计算机后，使用滑动窗口重建更新每个TR的形象，四交错螺旋读出，750毫秒TR和12毫秒回波时间获取每次扫描系列23片。相反，其中只有毕竟交错采集每个片新功能磁共振图像重建传统的重建，滑动窗口重建方法获取每个中间层27后的重建图像。 如先前27描述的处理用于两维网格重建，运动校正，以及时间序列的计算的原始数据。 使用阈值的一致性方法，通过如前面描述的27计算每个相对于刺激前收集到的基准期体素的BOLD信号的调制率来确定激活体素。计算相干值作为傅立叶幅度变换在反复刺激循环通过所有频率成分8的求和的平方除以频率。 使用的时间序列数据为各Voxel，平均运动修正的图像，属于同一刺激范例连续扫描第一。如前面所述27的平均4D图像然后对齐六学位的自由的刚体变换加上各向同性的缩放范围内与动物之间的比较常见的坐标系。