PCRによる日30ブタ胚の正確かつフェノールフリーDNA雌雄鑑別

家畜ブタはヒトおよび家畜の分野での開発、遺伝学や栄養学の基本的な研究テーマとなっています。人間の研究のための生物医学モデルとして豚の電位は、それらの生理学的類似性に起因することができます。家畜では、性比の操作は、選択と遺伝的改良プログラム¹の有効性を高めることができます。個々の胚を雌雄鑑別することは、遺伝子型、エピジェネティクスと初期胚の発育²時の性的二型のX不活性化を含むがこれらに限定されない多くの実験的調査に使用される基本的なツールです。

マウスでの研究は、母体の食事やその他の要因は男女の不均衡³をもたらし得ることを示唆しています。豚では、男女比の不均衡の原因は父方の品種^4、子宮容量⁵と、母豚の代謝条件^{6が含まれます} 。胚および同腹仔で観察された差異は、それ自体によって影響され得るのでxual二形は、研究者が自分の研究に関する結論を描画する前に胚のセックスと性比に注意する必要があります。開発の30日目にブタの胚を雌雄鑑別するための効率的なツールやプロトコルの開発は、ここで議論されます。

セックスタイピングの様々な方法がモデル生物と家畜の遺伝的研究のために開発されてきました。特に家畜で、男性と女性の初期胚を識別することは繁殖プログラムのための遺伝子選択性を高めるために非常に一般的です。ギムザ⁷または^8,9の技術はセックスタイピングのために使用されている強い蛍光を使用して、ブタにおける初期胚の染色体分析。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、迅速かつ正確に胚の多数をスクリーニングするには適していません。

最も効果的な性別のタイピング方法は、熱安定性DNAポリメラーゼおよびプライマーの対を用いてDNAの増幅です。 PCR法によるDNAの雌雄鑑別は、o-、より、具体的な迅速かつ高感度でありますNLY細胞物質の微量を必要とします。最初のPCRベースの胚性判別は、ヒト^10、およびそれ以降のマウスでは^11、牛^12、水牛¹³と羊¹⁴着床前胚で実施しました。豚では、最古のDNAのセックスタイピング法は、Y染色体特異的なDNAプライマー¹⁵の単一の対を介して着床前胚のために設立されました。しかし、性別決意のための最も一般的なPCRプライマーは、雄特異的なSRY遺伝子¹⁶とXとY染色体¹⁷の両方に位置するジンクフィンガー遺伝子の非性別判別領域のY染色体から選択しました。その後、これらのプライマーは、ジンクフィンガー遺伝子の唯一のX-染色体を検出するためのプライマーの改善された特異性を持つこの研究で30日目の胚の性別を決定するために適用されてきました。

ブタ着床前胚からのゲノムDNAをproteinasでバッファする無傷の胚盤胞を露出することによって抽出することができますE K ¹⁶または¹⁵個々の初期卵割胚から少数の細胞の生検を取り、直接PCRのためにそれらを使用します。しかし、大きさが数センチメートル以上ブタ血液、毛髪、組織または大受胎からのDNAの放出を効果的にプロテイナーゼK法を使用して行われていません。これらの材料のためのDNAの抽出方法は、時間がかかり、フェノール/クロロホルムプロトコル⁶または高価な列ベースのキット¹⁸のいずれかを使用して確立されています。潜在的に有害な化学物質の使用を回避するために、安価で、簡単で、フェノールを含まないDNA抽出方法を開発する傾向があります。マウス¹⁹およびゼブラフィッシュ²⁰組織からのPCR品質のゲノムDNAを単離するためのプロトコルのこのタイプのホット水酸化ナトリウム及びトリス（ホットショット）を使用して確立されています。本研究では、変更された名手でDNAを得るためのプロトコルを提供し、日の細胞溶解物から直接で30ブタ胚を入力してPCRのセックス二重のプライマー対を再設計しました高精度。