Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen
Summary
We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.
Abstract
During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.
Introduction
Adenoviren enthält ein doppelsträngiges DNA-Genom, das in den infizierten Zellkern repliziert. Wenn der Virus-DNA in den Zellkern, lokalisiert es neben PML nuclear bodies 1. Folgende virale frühe Genexpression wird die Kernarchitektur erheblich umstrukturiert Induzieren der Bildung von viralen Mikroumgebungen, bezeichnet als virale Replikation Compartments (RC) 2. Seit Adenovirus (Ad) RC sind Websites, auf denen Virusgenom Replikation und Expression der viralen späten Gene stattfinden, bieten sie eine Umgebung für die Rekrutierung von allen notwendigen viralen und zellulären Faktoren, die in diesen Prozessen zu beteiligen. Interessanterweise eine Vielzahl von zellulären Proteinen für die zelluläre antivirale Reaktion verantwortlich ist, wie das die DNA-Reparatur, die angeborene Immunantwort und Tumorsuppression kooptiert zu diesen viralen Orte 2. Daher kann Ad RC berücksichtigt werden regulatorische Hubs, die effiziente virale Replikation zu fördern, während gleichzeitig die Regulierung derzelluläre antivirale Antwort, die anzeigt, dass diese Strukturen sind der Schlüssel zum Verständnis der Virus-Wirt-Zell-Interaktionen. Dennoch sind die molekularen Mechanismen der RC Bildung, ihrer Zusammensetzung und damit verbundenen Tätigkeiten sind weitgehend unverstanden.
Adenoviralen RC sowie RC von anderen DNA-Viren, die im Zellkern repliziert sind nicht auf Membranen cytoplasmatische RC 3 zugeordnet ist, im Gegensatz. Darüber hinaus sind diese virusinduzierten Strukturen wahrscheinlich vollständig von Proteinen und Nukleinsäuren aufgebaut sein. RC in Zellen mit RNA-Viren infiziert gebildet (gewöhnlich als viralen Fabrik) isoliert, unter Ausnutzung ihrer zytoplasmatischen Lokalisation und membrangebundenen Status, der ihre detaillierte morphologische, funktionelle und biochemische Charakterisierung 4 erleichtert hat.
Nach unserem Kenntnisstand haben Atom viralen RC nicht isoliert wurden, möglicherweise aufgrund der Komplexität der Kernarchitektur und Abwesenheit der intranukleären membranes, die ihre Isolierung erleichtern würde. Ihre Studie wurde stattdessen auf die Immunfluoreszenzmikroskopie, Fisch und Transmissionselektronenmikroskopie verlassen. Doch trotz Komplikationen inhärenten Isolierung subnuclear Strukturen, andere Kernbereichen wie Kernkörperchen und Cajal Bodies haben, bevor 5,6 isoliert. Da Nucleoli und RC beide aus Proteinen und Nukleinsäuren besteht, und haben einen Durchmesser zwischen 0,5 – 5 um, stellten wir die Hypothese, dass RC auch zugänglich Isolation. Deshalb, um genauer zu charakterisieren, die molekulare Zusammensetzung und Funktionen RC verbunden sind, haben wir eine neuartige Methode, um subnuclear Fraktionen mit RC bereichert zu isolieren. Zu diesem Zweck stellten wir Sub-Kernfraktionen mit Geschwindigkeitsgradienten und Saccharose Kissen ähnlich Verfahren verwendet werden, um Kernkörperchen 7 oder sonstigen Kerndomänen 6 zu isolieren und gründete ein zellfreies System, das die Untersuchung der molekularen Zusammensetzung und die damit verbundenen Tätigkeiten erlaubtRC. Diese Technik ist daher das Verständnis der voran Virus-Wirt-Zell-Wechselwirkungen und ist ein mächtiges Werkzeug, das auch die detaillierte Analyse von RC zu erleichtern, sollte aus anderen Viren, die im Zellkern repliziert und induzieren Bildung replikations Abteile ähnliche Abmessungen wie jene in Adenovirus- gebildet infizierte Zellen, wie Herpesviren, Papillomaviren oder Polyomaviren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).
Materials
| DMEM | Gibco | 12100-046 | Warm in 37 ºC water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12484-028 | |
| Sucrose, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC |
| Dounce homogenizer | Kontess Glass Company | 884900-0000 | |
| Branson 1800 Ultrasonic Bath | Branson | Z769533 SIGMA | Turn on 15 min before use. |
| Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-036-003 | Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk |
| Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21121 | Use at a 1:2,000 dilution in PBS |
| Silane-Prep Slides | Sigma | S4651-72EA | Open in a laminar flow cabinet |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce ThermoScientific | 34080 |
Referencias
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