Summary

Isolation des fractions de sous-nucléaire réplication virale Compartiment enrichies d'adénovirus-infectés cellules humaines normales

Published: November 12, 2015
doi:

Summary

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Abstract

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

Introduction

Les adénovirus contiennent un génome d'ADN double brin qui se réplique dans le noyau de la cellule infectée. Quand l'ADN viral entre dans le noyau, il se localise à proximité de corps nucléaires PML 1. Après l'expression du gène précoce virale, l'architecture nucléaire est considérablement réorganisé, induire la formation de micro-environnements virales, appelées compartiments de la réplication virale (RC) 2. Depuis adénovirus (Ad) RC sont des sites où la réplication du génome viral et l'expression des gènes tardifs viraux ont lieu, ils fournissent un environnement pour le recrutement de tous les facteurs viraux et cellulaires nécessaires qui participent à ces processus. Fait intéressant, une variété de protéines cellulaires responsables de la réponse antivirale cellulaire, tels que la réponse aux dommages de l'ADN, la réponse immunitaire innée et la suppression tumorale sont co-voulu ces sites virales 2. Hubs réglementaires Ainsi, Ad RC peut être considérée comme favorisant la réplication virale efficace tout en régulant de façon concomitante de laréponse antivirale cellulaire, ce qui indique que ces structures jouent un rôle clé pour la compréhension des interactions cellulaires hôte-virus. Néanmoins, les mécanismes moléculaires de la formation RC, leur composition et les activités connexes sont mal comprises.

Adénoviral RC, RC ainsi que d'autres virus à ADN qui se répliquent dans le noyau ne sont pas associées à des membranes, par opposition à 3 RC cytoplasmique. De plus, ces structures induites par des virus sont susceptibles d'être entièrement composée de protéines et d'acides nucléiques. RC formé dans les cellules infectées par des virus à ARN (généralement appelé usines virales) ont été isolés, profitant de leur localisation cytoplasmique et le statut lié à la membrane, ce qui a facilité leur morphologique détaillée, la caractérisation fonctionnelle et biochimique 4.

À notre connaissance, RC virale nucléaire n'a pas été isolé, peut-être en raison de la complexité de l'architecture nucléaire et l'absence de m intranucléaireembranes qui faciliteraient leur isolement. Leur étude a misé plutôt sur la microscopie par immunofluorescence, FISH et microscopie électronique en transmission. Cependant, malgré les complications inhérentes à isoler les structures subnucléaires, d'autres domaines nucléaires tels que nucléoles et corps de Cajal ont été isolés avant 5,6. Depuis nucléoles et RC sont toutes deux composées de protéines et acides nucléiques, et ont un diamètre compris entre 0,5 – 5 um, nous avons supposé que RC doit aussi se prêter à l'isolement. Par conséquent, afin de caractériser plus précisément la composition moléculaire et les fonctions associées à RC, nous avons établi une nouvelle méthode pour isoler des fractions subnucléaires enrichis en RC. À cette fin, nous avons préparé des fractions de sous-nucléaire en utilisant des gradients de vitesse et des coussins de saccharose similaires aux procédures utilisées pour isoler nucléoles 7 ou d'autres domaines nucléaires 6 et établi un système exempt de cellules qui permet l'étude de la composition moléculaire et activités associésRC. Cette technique devrait donc progresser la compréhension des interactions cellulaires virus-hôte et représente un outil puissant qui devrait également faciliter l'analyse détaillée du RC d'autres virus qui se répliquent dans le noyau et induire la formation de compartiments de réplication de dimensions similaires à celles formées dans adénovirus -cellules infectées, comme les virus de l'herpès, papillomavirus, ou polyomavirus.

Protocol

1. HFF Culture cellulaire et Ad-infection Propager le virus wt Ad5 dans des monocouches de cellules HEK-293 et que les unités formant titre fluorescentes (FFU) sur les cellules HFF 8 comme décrit précédemment. Cultiver des fibroblastes humains (HFF prépuce) dans 10 ml de DMEM / 10% de sérum bovin fœtal (FBS) dans des plats de culture de 100 mm stériles à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur humidifié. Déterminer le nombre de cellules en utilisant une chambre de Ne…

Representative Results

Étant donné que les compartiments de replication virale (RC) sont des structures virales induites subnucléaires composées de protéines et acides nucléiques, similaire à d'autres domaines nucléaires, ils se sont avérés être prête à l'isolement par des gradients de vitesse sur la base des caractéristiques biochimiques. Les étapes critiques dans le protocole de fractionnement sont illustrés dans la Figure 1. A chaque étape les échantillons doivent être surveillé…

Discussion

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).

Materials

DMEM Gibco 12100-046 Warm in 37 ºC water bath before use
Fetal Bovine Serum Gibco 12484-028
Sucrose, Ultra Pure Research Organics 0928S Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC
Dounce homogenizer Kontess Glass Company 884900-0000
Branson 1800 Ultrasonic Bath Branson Z769533 SIGMA Turn on 15 min before use.
Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-036-003 Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk
Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-21121 Use at a 1:2,000 dilution in PBS
Silane-Prep Slides Sigma S4651-72EA Open in a laminar flow cabinet
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce ThermoScientific 34080

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Citar este artículo
Hidalgo, P., Gonzalez, R. A. Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells. J. Vis. Exp. (105), e53296, doi:10.3791/53296 (2015).

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