We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.
Manipulation och kultur av tidiga musembryon är en kraftfull men ändå till stor del underutnyttjade teknik öka värdet av detta modellsystem. Omvänt har cellodling använts i stor utsträckning i utvecklingsbiologiska studier. Det är emellertid viktigt att fastställa om in vitro-odlade celler representerar verkligen in vivo celltyper. Ympning celler i embryon, följt av en bedömning av deras bidrag under utvecklingen är en användbar metod för att bestämma potential in vitro odlade celler. I denna studie beskriver vi en metod för ympning celler i ett definierat ställe av tidig postimplantationsförlust musembryon, följt av ex vivo-odling. Vi introducerar också en optimerad elektroporering metod som använder glaskapillärer av känd diameter, som möjliggör exakt lokalisering och anpassning av antalet celler som får exogent DNA med både hög transfektionseffektivitet och låg celldöd. Dessa tekniker, som inte kräver någon specialized utrustning, gör experimentella manipulationer av gastrulation och tidiga organogenesen stadium musembryo möjligt att tillåta analys av engagemang i odlade cellsubpopulationer och effekten av genetiska manipulationer in situ på celldifferentiering.
Cellodling har använts i stor utsträckning i utvecklingsbiologi studier. Mouse embryonala stamceller (ESC) och epiblast stamceller (EpiSCs) kan differentiera till alla tre groddblad in vitro och är en användbar modell för celldifferentiering i början av däggdjur embryogenes. Härledningen av dessa cellinjer har öppnat en möjlighet för in vitro-manipulation och detaljerad utredning av lokal signaleringshändelser och transkriptions nätverk som verkar under tidig foster mönstring. Det är dock fortfarande viktigt att bestämma relevansen av eventuella manipulationer som utförs i odling in vivo. Har bedömts de vivo potential preimplantationsembryot härrörande mus ekonomiska och sociala råd genom att införa dem tillbaka till preimplantatorisk embryon (morulae eller blastocyster) 1. Men EpiSCs som representerar epiblasten celler i postimplantationsförlust embryon kan inte integreras effektivt i preimplantatorisk embryon 2,3. Vår previooss rön har visat att EpiSCs effektivt kan generera chimärer och bidra till alla groddblad när ympas in postimplantationsförlust embryon 4. Således är det bästa sättet att utvärdera de odlade cellerna in vitro för att introducera dem till deras motsvarande miljö in vivo.
Elektroporation är en allmänt använd metod för att leverera exogena molekyler in i målceller i både in vivo- och in vitro-experiment. Elektrisk energi kan generera ett stort antal porer i cellmembranet, vilket möjliggör exogen deoxiribonukleinsyra (DNA) eller ribonukleinsyra (RNA) att komma in i cellerna. En av de största utmaningarna för denna teknik är att kombinera optimal cellviabilitet med hög electrotransfection effektivitet 5,6. För elektroporering av nukleinsyror i embryonala vävnader, guldpläterade elektroder har oftast använts, så att målsökning av celler i ett brett rumslig intervall 7-9. För att uppnå en mer locaseras genöverföring har en nål formad elektrod använts för att uppnå en samlingspunkt elektriskt fält 10,11. Med användning av denna metod, de författare visade att efter elektroporering, hade cirka 30-60 celler tas upp DNA-konstruktionen 11. Ändå verkar det som exakt justera antalet elektroporerade celler fortfarande svårt med en fast bredd elektrod. Den kapillära elektroporering teknik har använts för att leverera plasmider till enstaka celler 12-14. Emellertid har denna teknik inte sökts electroporating plasmider att embryon ex vivo. På senare tid har en mikroanordning rapporterats lokalt electroporate några distala viscerala endoderm celler (mindre än 4 celler) i början av postimplantationsförlust musembryon 15. Emellertid är det fortfarande okänt om denna anordning effektivt kan rikta ektoderm och mesoderm ex vivo.
I denna studie beskriver vi två nya metoder för att bedöma cellulära och geners funktion i början av inlägget-implantation embryon. Vi visar först hur man ympa in vitro odlade celler i definierade platser i tidiga musembryon att bedöma deras in vivo potential. Integrationen av de transplanterade cellerna och deras ättlingar, alla märkt av en genetisk tagg (t.ex. ett grönt fluorescerande protein (GFP), kan undersökas ytterligare genom immunfärgning av vävnadsspecifika proteiner 4. För det andra, beskriver vi en förbättrad metod att exakt leverera DNA till lokaliserade ställen i embryot via elektroporering. Istället för att använda en nål formad elektrod, satte vi in en tunn tråd inuti en spetsig glaskapillär, och visa att denna modifiering kan leverera DNA till ett litet antal celler med hög effektivitet och begränsad celldöd. Dessutom visar vi att med hjälp av glaskapillärer med olika öppningsstorlekar, kan vi styra antalet elektroporerade celler. Därför anser vi att denna metod kan vara till stor nytta för att studera tidig embryonal mönstring som involverar ett litet antal of celler.
Ympning
Det kritiska steget för cell ympning experiment är införandet av en sammanhängande sträng av celler helst i en enda åtgärd, för att undvika upplösningen av klump. Denna teknik kräver lite övning för att kontrollera munnen pipett. Om donatorceller införliva väl i värden, kommer deras derivat dispergeras i embryot. För att ytterligare fastställa om de dispergerade donator härledda-celler differentierar på lämpligt sätt i värden, kan immunfärgning utföras på embryosektionerna. Om givarceller inte är förenliga med värdmiljön, de antingen inte kan upptäckas (som de utvisas från embryot) eller bildar unincorporated klumpar i embryon efter kultur. Om båda spridda celler och cellklumpar iakttogs, kan det tyda på att alltför många celler ympades och överdrivna givarceller som inte kan interagera med närliggande värdceller resulterade i klumpbildning. I detta fall skall ytterligare transplantat innehållandeett mindre antal celler kan utföras.
Den största begränsningen av cell ympningstekniken är att det inte är möjligt att fastställa den fulla in vivo potential celler eftersom musen ex vivo kultur under perioder längre än 48 timmar har inte uppnåtts. Men om det kombineras med ultraljud-styrda cellinjektion, kan det vara möjligt att överföra odlade celler till embryona i livmodern. För att sammanfatta, cell ympning experiment har använts i stor utsträckning i vår grupp och har gett oss värdefulla ledtrådar om potentialen hos olika celltyper 4,21,22 in vivo. Det är en teknik för allmän verktyg för att bedöma potentialen för in vitro-odlade celler in vivo i tidiga postimplantationsförlust embryon.
Elektroporering
Även i denna studie vi har bara visat att det är effektivt att använda kapillär elektroporering teknik för att rikta epiblasten, jagt är också möjligt att avsiktligt rikta andra groddblad såsom endoderm celler. Det kritiska steget för kapillären elektroporation teknik är att minimera den tid det tar att electroporate varje embryo (<5 min per embryo) eftersom PBS är mycket suboptimalt för tidiga musembryon. Våra data ovan har visat att i de flesta områden i embryon inte elektroporering inte påverka embryotillväxten. Men, elektroporering i noden orsakade onormal utveckling och ledde till för tidig död av embryot. Detta beror sannolikt på grund av skada eller dödsfall av de celler som bildar viktiga signalcentra 23. Följaktligen skulle denna region måste undvikas med denna teknik. En annan varning är att, som nämns i avsnittet resultat, medan epiblast eller primitivstrimman celler riktade vissa endoderm celler också elektro. Detta kan bero på DNA når till endoderm genom luckor under epiblasten epitel. Endoderm består av epitelceller och vår erfarenhet these celler har en högre benägenhet att ta upp DNA. Därför, när tillämpningen av denna teknik för öde kartläggning, är det viktigt att bedöma vilka celler initialt ta upp DNA.
Det bör också noteras att även om pCAG-GFP och pCAG-Cre: kan GFP plasmider effektivt levereras med hjälp av elektroporeringsparametrar som visas i denna studie, kan effektiviteten hos andra DNA-konstruktioner variera och behöver individuell optimering. Förändringar i DNA-koncentration, elektroporering spänning eller antalet pulser kan göras om plasmider har befunnits vara svåra att transfektera.
Sammanfattningsvis kan våra optimerade kapillär elektroporation systemet effektivt och reproducerbart leverera GFP eller Cre: GFP plasmider i ett fåtal celler i embryot med begränsad celldöd. Eftersom denna metod inte kräver dyra eller mycket specialiserad utrustning, kan det vara till stor nytta för att spåra cell studier eller testa effekten av ektopisk uttryck eller villkorlig radering of gener i tidiga embryon är om elektroporering utförs med embryon som bär floxed villkor muterade alleler. Därför ger denna elektroporering teknik ett användbart funktionellt verktyg för att förstå på en cell-för-cellbasis roller cell inneboende faktorer i samband med lokal vildtyp embryonala miljöer.
The authors have nothing to disclose.
We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council
Forceps | Dumostar | T5390 | |
Dissecting stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Stereomicroscope system with fluorescence | Nikon | AZ100 | |
Inverted microscope with a digital camera | Olympus | Olympus BX61 | |
Inverted confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
Low melting point agarose | Life Technologies | 16520-050 | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 11397863 | |
30mm Petri dishes | Fisher Scientific | 121V | |
4-well plates | Thermo scientific | 179820 | |
M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Pipettes | NICHIRYO | Nichipet | |
tips | Greiner Bio One | 685280 | |
Cell culture incubator | SANYO | MCO-17AIC | |
Roller culture apparatus | BTC Engineering | ||
Syringe filters 0.45µm, sterile | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
L-glutamine | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
Sodium pyruvate solution | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
Gas Cartridge for Portable Meker Burner | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Microforge | De Fonbrune | BS030301 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV830 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
ECM 830 square wave pulse generator | BTX | 45-0002 | |
Green food coloring dye | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye | Biotium | 40060-T | |
pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
Multimeter | Excel | XL830L | |
Micromanipulators | Leitz | ||
0.2mm diameter platinum wire | Agar Scientific | E404-2 | |
Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | |
Goat anti-Chicken IgY, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System | Dako | K3467 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
A far-red fluorescence nuclear counterstain | Life Technologies | T3605 |