We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.
जल्दी माउस भ्रूण के हेरफेर और संस्कृति शक्तिशाली अभी तक काफी हद तक कम उपयोग इस मॉडल प्रणाली का मूल्य बढ़ाने प्रौद्योगिकी एक है। इसके विपरीत, सेल संस्कृति को व्यापक रूप से विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, यह इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं को सही मायने में विवो प्रकार की कोशिकाओं में प्रतिनिधित्व निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। विकास के दौरान उनके योगदान के एक आकलन के द्वारा पीछा भ्रूण में कोशिकाओं ग्राफ्टिंग इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं की क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी तरीका है। इस अध्ययन में, हम पूर्व vivo संस्कृति के द्वारा पीछा जल्दी postimplantation माउस भ्रूण का एक निर्धारित साइट में कोशिकाओं ग्राफ्टिंग के लिए एक विधि का वर्णन है। हम भी उच्च अभिकर्मक दक्षता और कम कोशिका मृत्यु दोनों के साथ exogenous डीएनए प्राप्त कोशिकाओं की संख्या का सटीक स्थानीयकरण और समायोजन की इजाजत दी, ज्ञात व्यास का गिलास केशिकाओं का उपयोग करता है कि एक अनुकूलित इलेक्ट्रोपोरेशन विधि परिचय। किसी भी सपा की आवश्यकता नहीं है, जो इन तकनीकों में,ecialized उपकरण, gastrulation और जल्दी जीवोत्पत्ति चरण माउस भ्रूण संभव की प्रयोगात्मक जोड़तोड़, सुसंस्कृत सेल उप-जनसंख्या में प्रतिबद्धता और सेल भेदभाव पर बगल में आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभाव की इजाजत दी विश्लेषण प्रस्तुत करना।
सेल संस्कृति को व्यापक रूप से विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ESCs) और आद्यबहिर्जनस्तर स्टेम कोशिकाओं (EpiSCs) इन विट्रो में तीनों जनन परतों में अंतर है और जल्दी स्तनधारी भ्रूण में सेल भेदभाव के लिए एक उपयोगी मॉडल हो सकता है। इन सेल लाइनों की व्युत्पत्ति इन विट्रो हेरफेर और जल्दी भ्रूण patterning के दौरान परिचालन स्थानीयकृत संकेत घटनाओं और ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क की विस्तृत जांच के लिए एक अवसर के लिए खोल दिया है। हालांकि, यह संस्कृति में प्रदर्शन किसी भी जोड़तोड़ के vivo प्रासंगिकता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण बनी हुई है। preimplantation भ्रूण व्युत्पन्न माउस ESCs के इन विवो संभावित preimplantation भ्रूण (morulae या blastocysts) 1 में उन्हें वापस शुरू करने से मूल्यांकन किया गया है। हालांकि, postimplantation भ्रूण में आद्यबहिर्जनस्तर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते कि EpiSCs preimplantation भ्रूण 2,3 में कुशलता से एकीकृत नहीं कर सकते हैं। हमारे previoहमें निष्कर्षों postimplantation भ्रूण 4 में grafted जब EpiSCs कुशलता, काइमेरा पैदा करते हैं और सभी रोगाणु परतों के लिए योगदान कर सकते हैं कि पता चला है। इस प्रकार, इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए सबसे अच्छा तरीका विवो में उनके इसी पर्यावरण के लिए उन्हें लागू करने के लिए है।
Electroporation vivo में इन विट्रो प्रयोगों में दोनों में लक्षित कोशिकाओं में बहिर्जात अणुओं देने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है। विद्युत ऊर्जा बहिर्जात deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) या कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए Ribonucleic एसिड (आरएनए) की अनुमति देता है जो कोशिका झिल्ली में छिद्रों की एक बड़ी संख्या उत्पन्न कर सकते हैं। इस तकनीक के लिए सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक उच्च electrotransfection दक्षता 5,6 के साथ इष्टतम सेल व्यवहार्यता गठबंधन है। भ्रूण के ऊतकों में न्यूक्लिक एसिड की electroporation के लिए, सोने की एक व्यापक स्थानिक रेंज 7-9 में कोशिकाओं का निशाना बना अनुमति देता है, इलेक्ट्रोड सबसे अधिक इस्तेमाल किया गया है, चढ़ाया। एक अधिक लोका प्राप्त करने के लिएlized जीन स्थानांतरण, एक सुई के आकार इलेक्ट्रोड एक केन्द्र बिजली के क्षेत्र 10,11 प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया है। इस विधि का प्रयोग, लेखकों electroporation के बाद, चारों ओर 30-60 11 कोशिकाओं के निर्माण के डीएनए लिया था कि पता चला है। फिर भी, यह सही electroporated कोशिकाओं की संख्या को एडजस्ट करने के लिए एक निश्चित-चौड़ाई इलेक्ट्रोड के साथ मुश्किल बना हुआ है कि लगता है। केशिका electroporation तकनीक एकल कक्षों 12-14 को प्लास्मिडों वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इस तकनीक पूर्व vivo भ्रूण को प्लास्मिडों electroporating के लिए लागू नहीं किया गया। अभी हाल ही में एक microdevice जल्दी postimplantation माउस भ्रूण 15 में स्थानीय स्तर पर electroporate कुछ बाहर का आंत अन्तर्जनस्तर कोशिकाओं (कम से कम 4 कोशिकाओं) को सूचित किया गया है। हालांकि, यह इस उपकरण कुशलतापूर्वक बाहरी झिल्ली को निशाना बनाने और पूर्व vivo mesoderm कर सकते हैं कि क्या अभी भी अज्ञात है।
इस अध्ययन में हम जल्दी पोस्ट में सेलुलर और जीन समारोह का आकलन करने के लिए दो उपन्यास विधियों का वर्णन-implantation भ्रूण। हम पहली बार अपने इन विवो क्षमता का आकलन करने के लिए जल्दी माउस भ्रूण में परिभाषित साइटों में इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं भ्रष्टाचार के लिए कैसे प्रदर्शित करता है। grafted कोशिकाओं और उनके वंश के एकीकरण, सब एक आनुवांशिक टैग (जैसे, एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) द्वारा लेबल, आगे ऊतक विशिष्ट प्रोटीन के immunostaining द्वारा जांच की जा सकती है 4। दूसरे, हम ठीक डीएनए वितरित करने के लिए एक बेहतर विधि का वर्णन बल्कि एक सुई के आकार इलेक्ट्रोड का उपयोग करने से electroporation के माध्यम से भ्रूण में स्थानीय साइटों के लिए।, हम एक ठीक इत्तला दे दी कांच केशिका अंदर एक पतली तार डाला, और इस संशोधन उच्च दक्षता और सीमित के साथ कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के लिए डीएनए वितरित कर सकते हैं कि प्रदर्शित कोशिका मृत्यु। इसके अलावा, हम विभिन्न उद्घाटन आकार के साथ कांच केशिकाओं का उपयोग करके, हम electroporated कोशिकाओं की संख्या को नियंत्रित कर सकते हैं कि पता चलता है। इसलिए, हम ओ इस विधि छोटी संख्या को शामिल जल्दी भ्रूण patterning के अध्ययन करने के लिए बहुत काम का हो सकता है पर विश्वासच कोशिकाओं।
कलम बांधने का काम
सेल ग्राफ्टिंग प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण कदम पेड़ों का झुरमुट के गोलमाल से बचने के लिए, आदर्श एक एकल कार्रवाई में कोशिकाओं का एक सुसंगत स्ट्रिंग की प्रविष्टि है। इस तकनीक को मुँह पिपेट को नियंत्रित करने में कुछ अभ्यास की आवश्यकता है। दाता कोशिकाओं की मेजबानी में अच्छी तरह से शामिल हैं, तो उनके डेरिवेटिव भ्रूण में फैलाने जाएगा। आगे छितरी दाता ली गई कोशिकाओं की मेजबानी में उचित रूप से अंतर क्या यह निर्धारित करने के लिए, immunostaining भ्रूण वर्गों पर प्रदर्शन किया जा सकता है। दाता कोशिकाओं मेजबान वातावरण के साथ संगत नहीं कर रहे हैं, वे या तो पता चला (वे भ्रूण से निष्कासित कर दिया जाता है) या संस्कृति के बाद भ्रूण में अनिगमित clumps फार्म नहीं किया जा सकता। छितरी हुई कोशिकाओं और सेल झुरमुटों दोनों मनाया गया है, तो यह भी है कि कई कोशिकाओं grafted थे संकेत हो सकता है और आसपास के मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत नहीं कर सकते हैं जो अत्यधिक दाता कोशिकाओं पेड़ों का झुरमुट गठन में हुई। इस मामले में, अतिरिक्त ग्राफ्ट युक्तकोशिकाओं की एक छोटी संख्या में प्रदर्शन किया जा सकता है।
सेल ग्राफ्टिंग तकनीक की प्रमुख सीमा है कि यह अब से 48 घंटा हासिल नहीं किया गया है अवधि में माउस पूर्व vivo संस्कृति के बाद से कोशिकाओं से भरा इन विवो क्षमता का निर्धारण करने के लिए संभव नहीं है। अल्ट्रासाउंड निर्देशित सेल इंजेक्शन के साथ संयुक्त हालांकि, अगर यह गर्भाशय में भ्रूण को सुसंस्कृत कोशिकाओं को हस्तांतरण करने के लिए संभव हो सकता है। सेल ग्राफ्टिंग प्रयोगों व्यापक रूप से हमारे समूह में इस्तेमाल किया गया है और हमें विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 4,21,22 के vivo क्षमता के बारे में महत्वपूर्ण सुराग दे दिया है, संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए। यह जल्दी postimplantation भ्रूण में इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं के vivo क्षमता का आकलन करने के लिए सामान्य उपयोगिता की एक तकनीक है।
Electroporation
इस अध्ययन में हम केवल पता चला है हालांकि यह मैं आद्यबहिर्जनस्तर लक्षित करने के लिए केशिका electroporation तकनीक का उपयोग करने के लिए कुशल है किटी जानबूझकर ऐसे अन्तर्जनस्तर कोशिकाओं के रूप में अन्य रोगाणु परतों को लक्षित करने के लिए भी संभव है। केशिका electroporation तकनीक के लिए महत्वपूर्ण कदम पीबीएस जल्दी माउस भ्रूण के लिए बहुत suboptimal है के बाद से प्रत्येक भ्रूण (भ्रूण प्रति <5 मिनट) electroporate करने में लगने वाले समय को कम करने के लिए है। हमारे आंकड़े से ऊपर भ्रूण में अधिकांश क्षेत्रों में, electroporation भ्रूण के विकास को प्रभावित नहीं करता है, कि दिखाया गया है। हालांकि, नोड में इलेक्ट्रोपोरेशन असामान्य विकास के कारण होता है और भ्रूण की अकाल मृत्यु का नेतृत्व किया। इस वजह से महत्वपूर्ण संकेत दे केन्द्रों 23 कि फार्म कोशिकाओं की क्षति या मृत्यु होने की संभावना है। इसलिए, इस क्षेत्र में इस तकनीक के साथ से परहेज करना होगा। एक और चेतावनी परिणाम अनुभाग में उल्लेख किया है आद्यबहिर्जनस्तर या आदिम लकीर कोशिकाओं को निशाना बनाया गया है, जबकि, कुछ अन्तर्जनस्तर कोशिकाओं को भी electroporated थे, कि है। डीएनए आद्यबहिर्जनस्तर उपकला के तहत अंतराल के माध्यम से अन्तर्जनस्तर के लिए पहुंचता है, क्योंकि यह हो सकता है। अन्तर्जनस्तर उपकला कोशिकाओं से बना है और वें हमारे अनुभव में हैese कोशिकाओं के डीएनए को लेने के लिए एक उच्च प्रवृत्ति है। भाग्य मानचित्रण के लिए इस तकनीक को लागू इसलिए, जब यह शुरू में डीएनए हाथ में ले लिया है, जो कोशिकाओं का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
GFP प्लास्मिडों कुशलता से इस अध्ययन में दिखाया इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों का उपयोग कर दिया जा सकता है, अन्य डीएनए निर्माणों की दक्षता में भिन्न है और व्यक्तिगत अनुकूलन की जरूरत हो सकती है: यह भी pCAG GFP और pCAG-CRE हालांकि कि ध्यान दिया जाना चाहिए। प्लास्मिडों transfect करने के लिए मुश्किल हो पाए जाते हैं, तो डीएनए एकाग्रता, इलेक्ट्रोपोरेशन वोल्टेज या दालों की संख्या में बदलाव किया जा सकता है।
सीमित कोशिका मृत्यु के साथ भ्रूण में एक बहुत कुछ कोशिकाओं में GFP प्लास्मिडों: संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, हमारे अनुकूलित केशिका इलेक्ट्रोपोरेशन प्रणाली कुशलतापूर्वक और reproducibly GFP या रचनात्मक वितरित कर सकते हैं। इस विधि महंगा या अति विशिष्ट उपकरण की आवश्यकता नहीं है, यह सेल ट्रैकिंग की पढ़ाई के लिए या अस्थानिक अभिव्यक्ति या सशर्त विलोपन ओ के प्रभाव का परीक्षण करने में बहुत काम का हो सकताजल्दी भ्रूण में च जीन, यदि इलेक्ट्रोपोरेशन floxed सशर्त उत्परिवर्ती alleles ले जाने के भ्रूण में किया जाता है। इसलिए, इस electroporation तकनीक स्थानीयकृत wildtype भ्रूण वातावरण के संदर्भ में एक सेल-दर-सेल आधार पर सेल आंतरिक कारकों की भूमिका को समझने के लिए एक उपयोगी कार्यात्मक उपकरण प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council
Forceps | Dumostar | T5390 | |
Dissecting stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Stereomicroscope system with fluorescence | Nikon | AZ100 | |
Inverted microscope with a digital camera | Olympus | Olympus BX61 | |
Inverted confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
Low melting point agarose | Life Technologies | 16520-050 | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 11397863 | |
30mm Petri dishes | Fisher Scientific | 121V | |
4-well plates | Thermo scientific | 179820 | |
M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Pipettes | NICHIRYO | Nichipet | |
tips | Greiner Bio One | 685280 | |
Cell culture incubator | SANYO | MCO-17AIC | |
Roller culture apparatus | BTC Engineering | ||
Syringe filters 0.45µm, sterile | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
L-glutamine | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
Sodium pyruvate solution | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
Gas Cartridge for Portable Meker Burner | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Microforge | De Fonbrune | BS030301 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV830 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
ECM 830 square wave pulse generator | BTX | 45-0002 | |
Green food coloring dye | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye | Biotium | 40060-T | |
pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
Multimeter | Excel | XL830L | |
Micromanipulators | Leitz | ||
0.2mm diameter platinum wire | Agar Scientific | E404-2 | |
Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | |
Goat anti-Chicken IgY, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System | Dako | K3467 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
A far-red fluorescence nuclear counterstain | Life Technologies | T3605 |