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Biología del desarrollo

Geomagnetico Field (Gmf) e Stabilimento Evolution: studio degli effetti di Gmf Storno su<em> Arabidopsis thaliana</em> Sviluppo e Gene Expression

Published: November 30, 2015
doi:
10.3791/53286
, , , ,
1Department of Life Sciences and Systems Biology,University of Turin, 2Radcliffe Department of Medicine,University of Oxford, John Radcliffe Hospital

Summary

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Abstract

Una delle osservazioni più stimolanti di evoluzione delle piante è una correlazione tra la presenza di campo magnetico terrestre (GMF) rigiri (o escursioni) e il momento della radiazione di Angiosperme. Ciò ha portato ad ipotizzare che alterazioni GMF polarità possono svolgere un ruolo nell'evoluzione delle piante. Qui, si descrive un metodo per testare questa ipotesi esponendo Arabidopsis thaliana per invertire artificialmente condizioni GMF. Abbiamo usato un magnetometro a tre assi ei dati raccolti sono stati utilizzati per calcolare l'entità del GMF. Tre alimentatori DC sono stati collegati a tre coppie bobina Helmholtz e sono stati controllati da un computer per modificare le condizioni GMF. Le piante coltivate in piastre di Petri sono stati esposti sia normale e invertite le condizioni GMF. Sono stati inoltre effettuati esperimenti di esposizione Sham. Piante esposte sono stati fotografati durante l'esperimento e le immagini sono state analizzate per calcolare la lunghezza delle radici e le aree di foglie. Arabidopsis RNA totale è stato estratto e quantitativaTime-PCR reale (qPCR) è stato analizzato l'espressione genica di CRUCIFERIN 3 (CRU3), trasporto del rame protein1 (COTP1), Redox Responsive Trascrizione Factor1 (RRTF1), Fe superossido dismutasi 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal ascorbato perossidasi (tapX), un ascorbato citosolica Peroxidase1 (APX1), e NADPH / respiratorio proteina scoppio ossidasi D (RbohD). Quattro differenti geni di riferimento sono stati analizzati per normalizzare i risultati della qPCR. Il migliore dei quattro geni è stato selezionato e il gene più stabile per la normalizzazione è stato utilizzato. I nostri dati dimostrano per la prima volta che invertendo la polarità GMF utilizzando bobine triassiali ha effetti significativi sulla crescita delle piante e l'espressione genica. Questo supporta l'ipotesi che GMF inversione contribuisce a indurre cambiamenti nello sviluppo pianta che potrebbero giustificare una pressione superiore selettiva, portando infine a pevoluzione lant.

Introduction

Il campo magnetico della Terra (o equivalentemente il campo geomagnetico, GMF) è un fattore ambientale imprescindibile per tutti gli organismi viventi del pianeta, incluse le piante. La GMF è sempre stata una caratteristica naturale della Terra, così durante l'evoluzione, tutti gli organismi viventi sperimentato la sua azione. Un numero crescente di prove dimostra che il GMF è in grado di influenzare molti processi biologici 1. La GMF non è uniforme e vi sono differenze significative locali nella sua grandezza e direzione sulla superficie della Terra. La GMF sulla superficie della Terra mostra una vasta gamma di grandezze, che vanno da meno di 30 microtesla per quasi 70 microtesla. Il GMF protegge la Terra e la sua biosfera dagli effetti letali di vento solare deviando maggior parte delle sue particelle cariche attraverso la magnetosfera 2.

Le piante rispondono agli stimoli ambientali; e le risposte classiche a fattori abiotici come la luce e la gravità sono stati thoroughly descritto definendo le cosiddette risposte fototropiche e gravitropica. Molto poco, o nulla, si sa sui meccanismi di percezione e le risposte delle piante a campi magnetici, nonostante la pletora di lavori pubblicati su questo argomento e recentemente recensito 1. A differenza del campo gravitazionale, la GMF è cambiato costantemente nel corso dell'evoluzione dell'impianto rappresenta quindi un fattore di stress abiotico importante che è stata recentemente considerata una potenziale forza trainante alla fine di contribuire a piantare diversificazione e speciazione 2. Inversioni geomagnetiche (o escursioni) sono cambiamenti nella polarità del GMF. Durante la vita-storia della Terra, inversioni GMF si è verificato più volte. Questi esposti il ​​pianeta a periodi di ridotta forza GMF durante ogni transizione polarità. Alcuni autori hanno ipotizzato che queste transizioni periodi di bassa forza GMF avrebbero permesso radiazioni ionizzanti dal vento solare di raggiungere la superficie terrestre, inducendo in tal modo unasforzo coerente per gli organismi viventi, che avrebbe potuto essere abbastanza forte da indurre alterazioni del gene che alla fine portano a piantare evoluzione 2.

Un'analisi dettagliata di esperimenti che descrivono gli effetti dei campi magnetici sulle piante mostra un gran numero di notizie contrastanti, caratterizzate da una carenza di plausibili meccanismi di interazione biofisici. Molti esperimenti sono semplicemente irrealistico, mentre altri mancano un'ipotesi verificabile e, in ultima analisi, non sono convincenti 3. Negli ultimi anni, lo stato di avanzamento della ricerca sugli effetti dei campi magnetici sulla pianta è stato rivisto 2,4-11. Recentemente, l'effetto sia del campo magnetico a bassa ed alta è stata ampiamente discussa 1, con una particolare attenzione al coinvolgimento degli eventi di inversione GMF sull'evoluzione pianta 2.

Il mezzo più diretto per comprovare l'ipotesi che le inversioni GMF influenzano l'evoluzione pianta è di sintetizzare un GMFinversione in laboratorio testando la risposta delle piante alle condizioni di campo magnetico normali e invertiti. Per verificare l'ipotesi, quindi abbiamo costruito una ottagonale Helmholtz coil coppie campo magnetico sistema di compensazione triassiale (bobine triassiali), che è in grado di invertire precisione le normali condizioni GMF.

Abbiamo usato Arabidopsis thaliana come pianta modello e abbiamo testato l'effetto di inversione GMF sull'espressione genica di alcuni geni importanti: CRUCIFERIN 3 (CRU3), che codifica per una proteina di riserva 12S seme che è tirosina-fosforilata e il suo stato di fosforilazione è modulata in risposta di ABA nei semi di Arabidopsis thaliana 12,13; il rame Trasporti protein1 (COTP1), che codifica per una proteina superfamiglia trasporto heavy metal / disintossicazione con la funzione predominante nel suolo acquisizione Cu e polline di sviluppo 14; e Redox Responsive Trascrizione Factor1 (RRTF1),che codifica un membro del FER (fattore di risposta etilene) sottofamiglia B-3 di ERF / AP2 famiglia fattore di trascrizione che contiene un dominio AP2 che facilitano la sinergica co-attivazione di geni vie di espressione e conferisce tolleranza crociata per abiotiche e biotiche sottolinea 15.

Inoltre abbiamo anche analizzato cinque geni coinvolti nelle risposte allo stress ossidativo: Fe superossido Dismutase1, (FSD1), che codifica un enzima citoplasmatico che enzimaticamente e rapidamente converte l'anione superossido (O 2 -) e acqua (H 2 O) al perossido di idrogeno (H 2 O 2) e ossigeno molecolare (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), che codifica e che enzima che catalizza la ripartizione di H 2 O 2 in acqua e ossigeno 17,18; Thylakoidal ascorbato perossidasi (tapX), che codifica una cloroplastica perossidasi tilacoidale che distrugge H 2 O2 19; ascorbato Peroxidase1 (APX1), che codifica una perossidasi citosolico che scavenges H 2 O 2 e rappresenta uno dei potenziali bersagli di modificazioni post-traduzionali mediata da molecole derivate NO 20; e NADPH- respiratoria proteina scoppio ossidasi D (RbohD) che codifica un enzima che genera O 2 – e svolge un ruolo cardine nella regolazione della crescita, lo sviluppo e le risposte allo stress in Arabidopsis 21.

La nostra metodologia campo inversione fornisce la prima evidenza che GMF inversione può indurre un cambiamento significativo nell'espressione genica morfologia e di A. radici e germogli. thaliana Questo protocollo fornisce un modo innovativo per valutare l'effetto di inversione GMF sulla morfologia delle piante e l'espressione genica e può essere utilizzato per valutare l'effetto potenziale di GMF inversione su altri aspetti del comportamento delle piante, e quindi guidare discussione del role di GMF inversione sull'evoluzione delle piante.

Protocol

1. Impostazione della triassiale bobine NOTA: la figura 1 mostra le bobine triassiali utilizzati per invertire la GMF. Accendere il magnetometro a tre assi, cui sonda è inserita nelle bobine triassiale. Accendere il computer e avviare il software magnetometro che consente ai dati di essere raccolti da tre assi del magnetometro. Utilizzare i valori dei componenti riportati dal magnetometro per calcolare la grandezza del GMF. Ad esempio, con valori magnetometro: Bx = 6.39 microtesla, Da = 36.08 microtesla, Bz = 20.40 microtesla calcolare un'intensità di campo di 41.94 mT utilizzando la seguente equazione: B = B GMF + B supplementare, dove altro B = (Bx 2 + Con 2 + 2 Bz) ½ (cioè 41.9 mT nell'esempio.) Accendere i tre alimentatori in corrente continua (dual range: 0-8V / 5A e 0-20V / 2.5A, 50W) ciascuno collegato a tre couples di bobine di Helmholtz e collegato ad un computer tramite una connessione GPIB (Figura 1B). Impostare tensioni degli alimentatori per generare il campo magnetico desiderato con un campo vettoriale magnetico inverso. Ad esempio, con B GMF come al punto 1.3 e con le dimensioni della bobina della strumentazione qui descritto, impostare le tensioni V x = 0,00 V, V y = 30.52 V, V z = 0.00 V per generare un nuovo risultante B = B + B GMF bobine triassiali = (6.38, -36,08, 20.39) microtesla. cioè, un nuovo campo con lo stesso ordine di grandezza B GMF, ma punta a una direzione diversa. Verificare il nuovo campo con il software magnetometro utilizzando la procedura descritta in 1.3. Esporre piante sia per normale e invertita condizioni GMF utilizzando piastre di Petri come descritto nella sezione 2. Eseguire esperimenti esposizione sham mantenendo l'intensità del campo pari a | B GMF | e conservazionela componente verticale del campo uguale a quella della GMF ma alterare la direzione (cioè, "Nord, est o ovest") del componente orizzontale del campo con correnti uguali nelle bobine triassiali rispetto alla condizione inversione di campo. A tale scopo, alterando la tensione delle bobine come descritto in 1.5. Nota: Regole Questa esposizione farsa fuori potenziale di riscaldamento sottile o effetti vibrazionali da entrambi le bobine stesse o dalle elettronici usati per controllare le bobine. Eseguire esperimenti in doppio cieco, applicando le condizioni del campo accecati dal personale che svolgono il resto degli esperimenti e / o di interpretazione dei dati. 2. Preparazione dei Materiali e condizioni per la crescita delle piante vegetali Utilizzare semi di Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia 0 (Col 0), quindi inserire in una provetta da 1,5 ml e sterilizzare superficie mediante trattamento con un 5% (w / v) Soluzione di ipoclorito di calcio e 0,02% (v / v) Triton X-100 in 80% di etanolo (EtOH), per 10-12 minuti a 25-28 ° C, con agitazione continua. Poi risciacquare due volte con 80% EtOH, lavare con il 100% EtOH ed infine risciacquare con acqua distillata sterile. Preparare 1 L di Murashige e Skoog 22 (MS) modificato con l'aggiunta di medio: 2.297 g di SM (0,5 x MS basale Salt Miscela), 10 g di saccarosio, acqua deionizzata fino a 1 L, pH 5,8-6,0 regolato con KOH. Aggiungere 16 g di agar e autoclave per 20 min, 120 ° C. Prima di solidificazione, versare 80 ml ​​di terreno in ciascuna (120 x 120 mm 2) piastre Petri quadrati. Seminare trenta semi sterili sul piatto, e quindi sigillare le piastre con un film ceroso. Vernalize le piastre orizzontalmente al buio a 4 ° C per 2 giorni per potenziare e sincronizzare la germinazione, e quindi esporre piastre Petri di normale o invertita GMF. Esporre semi in un ambiente controllato climatica a 22 ° C in posizione verticale in esperimenti paralleli sia all'interno delle bobine triassiali e fuori le bobine triassialisotto un programma fotoperiodo di 8 ore tenebre e la luce 16 ore, utilizzando lampade a vapore di sodio (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Utilizzare un film di gelatina blu per spotlight per ridurre la componente rossa delle lampade. Esporre piante per 10 giorni prima di estrazione di RNA sia normale (controllo) e inversione (trattamento) GMF condizioni. Dopo l'esposizione, scattare foto di piastre di Petri. Utilizzare il software ImageJ per calcolare lunghezza aree radice e foglia. Brevemente, misurare il lato della piastra Petri, quindi aprire l'immagine della piastra Petri e utilizzando l'opzione "diritta" linea per disegnare una linea che attraversa esattamente il lato piatto. Nel menu "analizzare" selezionare "scala set" e inserire la distanza effettiva nella casella "distanza nota" (ad esempio, 120 mm), quindi inserire l'unità di lunghezza (mm); infine fare clic sull'opzione "globale" per configurare le impostazioni disponibili per tutte le misurazioni. Per roolunghezza t, seguire attentamente la forma della radice utilizzando lo strumento a mano libera. Misurare la lunghezza utilizzando l'opzione "misura" nel menu "analizzare". Continuerà a misurare tutte le radici nella foto e salvare il file per ulteriori analisi statistiche. Per superficie fogliare, dal menu "immagine", utilizzare l'opzione e quindi "soglia di colore" regolare. Selezionare la foglia individuo e nel menu "analizzare" selezionare "analizzare particelle". Salvare le singole misure per le analisi statistiche. 3. Arabidopsis RNA totale Estrazione, Quantitative Real-Time PCR (qPCR) Condizioni di reazione e Primer per Arabidopsis Raccogliere separatamente 30 germogli e 30 radici e congelare immediatamente in azoto liquido. Poi macinare in azoto liquido con mortaio e pestello. Isolare RNA totale utilizzando un kit di purificazione e kit per il trattamento DNasi RNase-Free utilizzando manufacturistruzioni di Er. Verifica qualità e quantità del campione utilizzando un kit di RNA elettroforesi nano e gel capillare secondo le istruzioni del produttore. Confermare la quantificazione di RNA spettrofotometricamente. Utilizzare 2 mg di RNA totale e primer casuali utilizzando un kit cDNA trascrizione inversa per ottenere primi cDNA filo secondo le raccomandazioni del costruttore. Eseguire tutti gli esperimenti su un Real-Time System con SYBR Green con ROX come standard di carico interno. Eseguire la reazione con 25 ml di miscela costituita da 12,5 ml di 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 ml di cDNA e 100 primer nm. Utilizzare i primer elencati nella tabella 1. Includere nei controlli controlli non-RT (utilizzando RNA totale, senza trascrizione inversa per monitorare la contaminazione del DNA genomico) e controlli non di modello (acqua invece di modello). Calcola Primer efficienza per tutte le coppie di primer che utilizzano lo standardmetodo della curva 23. Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min a 95 ° C, 40 cicli di 15 s a 95 ° C, 30 sec a 58 ° C, e 30 sec a 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3, tapX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min a 95 ° C, 40 cicli di 15 s a 95 ° C, 20 sec a 57 ° C e 30 secondi a 72 ° C. Leggere fluorescenza dopo ciascuna fase di ricottura e di estensione. Per tutte le corse, eseguire un sondo da 55 a 95 ° C includendo il segmento di dissociazione nel profilo termico. Utilizzare la schermata curva di dissociazione, si accede dalla scheda dei risultati per visualizzare il profilo di dissociazione (trama della fluorescenza in funzione della temperatura). Verificare che il set di dati raccolti durante il segmento di dissociazione dell'esperimento viene selezionato per l'analisi utilizzando la schermata di analisi / Setup. Determinare il lgamma inear concentrazione modello a valore di ciclo soglia (valore Ct) eseguendo una serie di diluizioni di dieci volte (da 1 a 10 3 fold) utilizzando cDNA da tre estrazioni di RNA indipendenti analizzati in tre repliche tecniche 24,25. Analizzare tutti i grafici di amplificazione con la Real-Time PCR strumento software per ottenere valori Ct. Calibrare e normalizzare i livelli di RNA relativi al livello dei migliori geni housekeeping come segue: 3.11.1) Accedi al amplificazione schermata trame attraverso la scheda Risultati, selezionare la rampa o plateau per cui i dati devono essere analizzati mediante lo schermo / Setup Analysis Selection, e quindi selezionare il DRN (baseline corretta fluorescenza normalizzato) dal menu a fluorescenza sul pannello di comando. Accedi al piatto dello schermo Valori di esempio attraverso la scheda Risultati per visualizzare i valori Ct per i pozzi campionati. Utilizzare quattro geni di riferimento diversi [ad esempio, citoplasmatica deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato, (GAPC2), ubiquitina specific proteasi 6 (UBP6), Actin1 (ACT1) e il fattore di allungamento 1B subunità alfa 2 (eEF1Balpha2)] per normalizzare i risultati della PCR in tempo reale. Selezionare la classifica top gene utilizzando un software di analisi 26; e utilizzare il gene più stabile per la normalizzazione. Brevemente, organizzare i dati di ingresso in un foglio Excel con la prima colonna contiene i nomi dei geni e prima riga contenenti i nomi dei campioni. Quindi selezionare il software di analisi dal menu-bar. Utilizzare la finestra di dialogo per selezionare i dati di input. Successivamente, verificare i campi nomi dei campioni, i nomi di geni e di uscita semplice solo. Fare clic sul pulsante Vai per eseguire l'analisi. Selezionare la parte superiore gene classificato (che ha il valore di stabilità più piccolo) come gene candidato più stabilmente espresso. Dati Plot mostrando l'espressione fold change differenziale sia germogli e radici. 4. Analisi statistica Esprimere i dati come valori medi ± errore standard. Confrontare il control e i gruppi di trattamento per l'esecuzione di analisi della varianza (ANOVA) e il test di Tukey con Bonferroni e Dunn-Sidak prova Probabilità rettificato (0,95 fiducia%).

Representative Results

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un metodo per valutare se l'inversione del campo magnetico terrestre (GMF), può influenzare lo sviluppo delle piante e l'espressione genica di Arabidopsis thaliana ecotipo Col 0. bobine triassiali come mostrato in Figura 1A sono utilizzati per invertire la GMF quando set con le tensioni di unità appropriate (Figura 1B), ottenuto come descritto al punto 1.5 nel protocollo. Le dimensioni delle bobine triassiali sono ~ 2 x 2 x 2 m 3, che ha permesso spazio sufficiente con condizioni GMF invertiti per ospitare più piastre di Petri. I controlli sono stati coltivati ​​nelle stesse condizioni ambientali e alle normali valori GMF. Dopo 10 giorni di esposizione normale e invertita condizioni GMF, il fenotipo delle piante mostrato evidenti alterazioni morfologiche. Come mostrato in figura 2, piante di controllo (cioè, coltivati ​​in condizioni normali GMF) mostravano lunghezze radicolari con Prob significativamente (Dunn-Sidak e Bonferroni rettificato <0,001;T di Student = 10,68, df = 31) valori elevati (29.41 mm; SEM = 1,04; N = 32) rispetto alle piante esposte a invertita GMF (17.53 mm; SEM = 0,58; N = 36). Negli impianti GMF-invertite, la morfologia dei germogli è stata anche modificata mostrando un ridotto sviluppo di espansione foglio. Le piante esposte a condizioni normali hanno mostrato una superficie media foglia di 4,95 millimetri 2 (SEM 0,025, N = 54), mentre le piante esposte a condizioni GMF invertite hanno mostrato in modo significativo (Dunn-Sidak e Bonferroni rettificato Prob = <0.001; t di Student = 31.32, df = 53) valori foglia inferiore dell'area (3,71 millimetri 2; SEM = 0.032; N = 54). Pertanto, l'esposizione di Arabidopsis a condizioni invertite GMF ha indotto una riduzione in lunghezza radice e superficie fogliare. Foglia espansione e la crescita delle radici dipendono sia la divisione e l'allungamento di 27 cellule. Pertanto, lo sviluppo della pianta, la produttività e la forma fisica generale dipendono da un ottimale Ripresa e la radice del sistema architettura <sup> 28. La lunghezza della radice e foglia ridotte dimensioni delle piante esposte a condizioni GMF invertiti indica la presenza di un sistema di rilevamento in grado di percepire non solo variazioni di intensità del campo magnetico, ma anche per rispondere alle variazioni del campo magnetico "direzione" rispetto alla gravità. L'ipotesi che GMF inversione può influenzare la crescita delle piante trova prove convincenti nei nostri esperimenti, che dimostrano che le condizioni di inversione GMF possono influenzare in modo significativo lo sviluppo della pianta. I cambiamenti morfologici sono stati accompagnati anche da cambiamenti nell'espressione genica. Tra geni housekeeping, il gene più stabile era il fattore di allungamento 1B subunità alfa 2. Il primo gruppo di geni (CRU3, COTP1, RRTF1) mostrava un'alterazione drammatica dell'espressione genica (Figura 3). Sparare espressione di tutti i tre geni è risultato significativamente aumentato (P <0,05) di circa 2,5 volte in impianti esposti a riservad condizioni GMF. Espressione radice di CRU3 stata sovraregolati nelle radici di piante esposte a condizioni normali di GMF, ma era significativamente (P <0.05) downregulated in condizioni GMF invertiti. L'opposto è stato trovato per COTP1 e RRTF1, che sono stati downregulated in condizioni normali e upregulated in presenza di GMF inversione (Figura 3). Cruciferin (una globulina 12 S) è il più abbondante proteina di riserva nei semi di A. thaliana e altre crocifere e viene sintetizzata come un precursore nel reticolo endoplasmatico rugoso. E 'poi ​​trasportato ai vacuoli di stoccaggio delle proteine ​​13. Piantina germinazione richiede la ripartizione dei cruciferin, che viene utilizzato come una prima fonte di azoto. Down-regulation dei cruciferin degrado riduce lo sviluppo di embrioni alterando strutture cellulari o componenti delle cellule di sviluppo 29,30. I nostri risultati mostrano che la sovraregolazione di CRU3 correla conminore espansione del foglio e una lunghezza radice ridotta, indicando così che questo gene in sensibile a GMF inversione e che la sua sovraespressione può contribuire alla riduzione dello sviluppo delle piante. Inoltre, GMF inversione induce una sottoregolazione significativa di CRU3 nelle radici, che è correlato con una lunghezza radice ridotta. Il rame è un cofattore essenziale per i processi chiave di piante, ma esercita effetti dannosi quando in eccesso; quindi, overexpressing trasporto del rame compromette la crescita delle piante. L'effetto di GMF inversione è stata una sovraespressione significativo di COTP1 in entrambi i germogli e le radici, spiegando così la crescita delle piante ridotta. Lo stress Ion altera il metabolismo dei cloroplasti, che è strettamente legata allo stato redox della cellula. In Arabidopsis il fattore di trascrizione RRTF1 è importante per l'espressione di geni associati alla capacità di adattarsi a cambiamenti redox 31. Pertanto, quando le piante sono esposte a stimoli esterni possono modificare il loro sviluppo fisiologico eAl programmi è prevista una sovraespressione di questo importante fattore di trascrizione. Inversione del GMF indotto un significativo sovraespressione di RRTF1 in entrambi i germogli e le radici, indicando così le risposte più elevati di stress ossidativo delle piante alle condizioni GMF invertiti. Risultati interessanti sono ottenuti analizzando i cinque geni coinvolti nello stress ossidativo. In generale, tutti i geni estratti e analizzati nei germogli non mostrano differenze significative (P> 0,05) quando le piante sono state coltivate in condizioni normali o invertiti GMF (Figura 4 e Figura 5). Tuttavia, un significativo down-regulation è sempre osservata in radici di piante esposte a condizioni GMF invertiti. In particolare, CAT3 ha mostrato la down-regulation più alta (Figura 5), seguita in ordine di sottoregolazione da APX1, FSD1, RBOHD e tapX (Figura 4). Tolleranza trasversale di unstress biotici e biotici è fornito dalla attivazione di diversi geni coinvolti in numerose vie biochimiche. fattore di trascrizione RRTF1 facilita la sinergica coattivazione dell'espressione genica di queste vie 15,31, e può essere potenzialmente coinvolti nello stress ossidativo 32. Pertanto, upregulation di RRTF1 è previsto quando scavenging ossigeno si riduce. L'abbassamento di radice enzimi evacuazione correla con la upregulation di RRTF1, che agisce in risposta a un aumento dello stress ossidativo. La drammatica downregulation radice di CAT3, APX1 e tapX indica la ridotta capacità delle cellule di root per pulire H 2 O 2, che è accompagnato dalla ridotta capacità di dismutate l'anione superossido da sottoregolazione di FSD1. Le risposte lo stress ossidativo è più elevata nelle radici, che sembrano essere il luogo principale di invertito percezione GMF. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Figura 1. geomagnetico sistema di compensazione campo. (A) bobine triassiali (comprendenti una coppia di bobine ottagonali per ciascuno dei tre assi perpendicolari) utilizzati per invertire il campo vettoriale geomagnetico. (B) Un alimentatore controllato da computer è connesso a ciascuna coppia di bobine di Helmholtz. (Tensioni all'interno di queste cifre sono arbitrari) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Effetti di inversione di campo geomagnetico su Arabidopsis morfologia. Dopo dieci giorni di esposizione, piante di controllo (ad esempio, quelli esposti alle normali condizioni GMF) mostrano una significativa maggior lunghezza radice e più expanvolantini ded rispetto agli impianti che sono stati esposti a condizioni GMF invertiti. Bar metrico = 18 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. Effetti di inversione di campo geomagnetico sull'espressione genica Arabidopsis. Dopo dieci giorni di esposizione, RNA totale di controllo e piante trattate è stato estratto ed analizzato mediante Real-Time PCR per l'analisi di espressione. L'effetto di inversione del GMF è stato quello di indurre un cambiamento drastico nella espressione genica di tutti i geni che sono stati testati CRU3, Cruciferin 3;. COTP1, rame Trasporto protein1; RRTF1, Redox Responsive Trascrizione Factor1. Barre indicano errore standard; asterischi indica significative (p <0,05) differenze tra plformiche esposti a condizioni GMF invertito e normali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4. Effetti di inversione di campo geomagnetico su Arabidopsis geni antiossidanti legate. Dopo dieci giorni di esposizione, l'RNA totale di controllo e di piante trattate è isolato e impiegato per l'analisi dell'espressione genica mediante Real-Time PCR. L'effetto di inversione del GMF è stato quello di indurre cambiamenti significativi nell'espressione genica sparare; tuttavia, un drastico downregulation è stata osservata in espressione genica radicale delle piante coltivate in condizioni GMF invertite tapX, Thylakoidal Ascorbato perossidasi,. APX1, ascorbato Peroxidase1, FSD1, Fe superossido Dismutase1; RbohD, NA. DPH / respiratoria scoppio ossidasi proteina D Bar indicano errore standard; asterischi indica significativi (p <0.05) le differenze tra le piante esposte a condizioni invertite GMF e normali. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5. Effetti della inversione di campo geomagnetico su Arabidopsis catalasi 3 (CAT3) l'espressione genica. Dopo dieci giorni di esposizione, l'RNA totale di controllo e di piante trattate è isolato e impiegato per l'analisi dell'espressione genica mediante Real-Time PCR. L'effetto di inversione del GMF è stato quello di indurre cambiamenti significativi nell'espressione genica sparare; tuttavia, una drastica downregulation stata osservata espressione genica radicale delle piante coltivate in condizioni GMF invertiti. Barre indicano erro normar; asterischi indica significativi (p <0.05) le differenze tra le piante esposte a condizioni invertite GMF e normali. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Abbiamo recentemente dimostrato che esiste una correlazione tra la stupefacente inversioni GMF e il momento in cui la deviazione della maggior parte dei lignaggi Angiosperme familiari verificato 2. Tuttavia, nonostante le ipotesi stimolanti e la pletora di studi sugli effetti di varie intensità GMF, l'ipotesi che GMF inversione stessa può indurre cambiamenti significativi nell'espressione genica delle piante e la morfologia non è mai stata dimostrata. Qui mostriamo per la prima volta, un metodo che utilizza un triassiale ottagonale bobina di Helmholtz per invertire GMF nel nostro laboratorio, e che l'inversione del campo magnetico ambientale può causare variazioni fenotipiche e la modulazione dell'espressione genica nelle piante.

Per ottenere GMF inversione (o modifica) in un volume sufficiente per gli esperimenti di crescita delle piante (2 x 2 x 2 m 3), abbiamo costruito un sistema di bobine di Helmholtz ottagonale. Questo sistema non è disponibile in commercio (bobine di Helmholtz solito sono sagomate ad anello e più piccolo)e le spese per la costruzione sono stati notevoli. È importante sottolineare che questo sistema offre robusto modifica campo, con eccezionale tempo stabilità e l'omogeneità del campo magnetico modificati.

Il sistema è progettato e costruito per ridurre il valore della GMF di un millesimo delle condizioni normali o invertire qualsiasi delle tre dimensioni del campo magnetico. Tuttavia, la progettazione delle bobine non consente di generare una alta intensità di campo magnetico. Pertanto, questo strumento nella forma attuale non è adatto per esperimenti volti a valutare l'effetto della elevata resistenza di campo magnetico su piante o altri organismi.

In laboratorio, alterazione della GMF simili a quelli descritti in questo metodo è stato ottenuto con metodi diversi, compresi schermatura circondando la zona sperimentale da piastre metalliche ferromagnetiche con elevata permeabilità magnetica, che si discostano campi magnetici e li concentrano all'interno del metallo stesso. The vantaggio di utilizzare bobine di Helmholtz è che il sistema permette alle piante di essere esposti a condizioni più naturali (luce, la ventilazione, ecc), che lo rendono ideale non solo per gli studi de vitro (come con l'uso di piastre Petri) ma anche de vivo la crescita delle piante e gli esperimenti di sviluppo. Le dimensioni del nostro sistema creano uno spazio che permette una soppressione fino a <1 / 1000e del natural GMF tutto a 25 x 25 x 25 cm 3 volume sferico (vedere Figura 1A), permettendo così di ospitare più piastre Petri o qualche piccola vasi per la crescita delle piante.

Il metodo qui presentato è stato applicato a studi di biologia vegetale; tuttavia, il sistema consente una vasta gamma di sperimentazione, compresi virologia e microbiologia, nonché studi su nematodi (Caenorhabditis elegans, ad esempio), artropodi e piccoli animali (compresi topi e ratti). Pertanto, test dell'ipotesi che l'inversione del GMF è in gradoper indurre cambiamenti morfologici e trascrizionali potrebbe anche essere esteso a molti altri sistemi viventi, forse in ultima analisi anche per le cellule umane.

La GMF è in continua evoluzione e fluttuante. Pertanto, nei nostri esperimenti una sfida importante è quello di fornire una costante compensazione della GMF per ottenere i nuovi valori GMF desiderati. Questo può essere raggiunto solo da un controllo continuo di valori dei campi magnetici attraverso la lettura dei valori magnetometri e compensazione della tensione. Pertanto, il sistema può compensare la parte lentamente variabile della GMF ma non fa nulla per le fluttuazioni di frequenza superiore.

In conclusione, l'utilizzo di bobine triassiali per invertire il vettore GMF stato determinante per dimostrare che questa inversione del vettore GMF è in grado di indurre vegetali cambiamenti morfologici e l'espressione genica differenziale. I risultati ottenuti con il metodo presentato forniscono una prova convincente a sostegno dell'ipotesi che la ri GMFversals avrebbe potuto essere una delle forze trainanti per l'evoluzione piante su scale temporali geologiche 2.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).

Materials

three-axis magnetometer Bartington  Mag-03MC triaxial fluxgate magnetometer
Magnetometer power supply Bartington  Mag-03PSU triaxial fluxgate magnetometer
Magnetometer software Bartington  Mag03DAM triaxial fluxgate magnetometer
DC power supply  Agilent Technologies E3642A
Calcium hypochlorite  Sigma 211389
Triton X-100  Sigma X100 
Ethanol  Sigma 2860
GroLux Sodium vapor lamps  OSRAM Sylvania 600W
RNeasy Plant RNA kit  Qiagen 74903
RNase-Free DNase  Qiagen 79254
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938B
NanoDrop ND-1000  Thermo Fisher Scientific not available
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit  Applied Biosystems 4368813
Mx3000P Agilent Technologies 401512
2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix  Fermentas International, Inc K0221
Parafilm Sigma P7793-1EA
Murashige and Skoog Basal Medium Sigma M5519 
Petri dish square (120×120) Sigma Z692344 
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Bertea, C. M., Narayana, R., Agliassa, C., Rodgers, C. T., Maffei, M. E. Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression. J. Vis. Exp. (105), e53286, doi:10.3791/53286 (2015).
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