신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과
Summary
Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.
Abstract
상대적으로 대기 체세포 줄기 세포는 대부분의 성인 조직에서 평생 세포 재생을 지원합니다. 성인 포유류 뇌의 신경 줄기 세포는 두 가지 특정 신경 인성 틈새로 제한됩니다 해마의 치아 이랑과 심실-뇌실 영역의 subgranular 영역, 측면의 벽 (V-SVZ는 subependymal 영역 또는 SEZ라고도 함) 심실. 장기 줄기 세포에서 원하는 유전자의 발현 및 유래 자손 결과 성체 줄기 세포 집단에 대한 생체 내 유전자 전달 전략의 개발 (즉, 포유 동물의 뇌들)은 현재 생물 의학 및 생명 공학 연구에서 중요한 도구이다. 여기서, 직접 생체 내 방법은 정맥 주사에 의한 세포주기 독립적 감염 V-SVZ 틈새 고도로 전문화 cytoarchitecture 활용 성인 마우스 V-SVZ 세포의 안정한 유전 적 변형을 위해 제공된다. 구체적으로는, 현재 프로토콜을 포함V-SVZ 자체 하나에 특정 유전자의 발현 카세트를 인코딩 빈 정맥 주사 (제어) 또는 정맥 주사의 주입은 뇌실막의 타겟팅, 생체 내 틈새에있는 세포의 모든 유형의 타겟팅, 또는 측면 뇌실 루멘으로,이야 세포 만. 발현 카세트는 허용, 또한 정맥 주사에 의해 코딩되는 형질 세포 및 형광 단백질의 게놈 내로 통합되는 표지화 된 세포 및 세포 자율 및 비 – 자율 틈새 의존적 효과 분석 형질 세포의 검출 그들의 자손.
Introduction
뮤린 심실-뇌실 영역 (V-SVZ)는 선조체 대향 뇌실의 벽에서 매우 활성 종자 영역 인 후각 망울의 지속적인 생산 전구 세포 복제 및 분화 결과 연속 처리 (OB )의 interneurons 및 뇌량의 희소 돌기 아교 세포 (1). , 성상 세포 항원 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)을 표현하고 같은 네 스틴, Id1을 같은 세포 마커 줄기, 이러한 세포의 평생 세대는 신경 줄기 세포 (또한 B1 세포라고 NSCs을)이 지역의 존재에 의해 지원 될 것으로 보인다 및 Sox2이 2. B1 세포가 교통 전구를 증폭 전사가 Dlx2 요인 표현 (TAP) 세포 (C 세포) 생성 GFAP 발현 (말초없는 호 메오 박스 2) Ascl1 (포유류 achaete-schute 동족체 1) 그들이 야기하기 전에 신속하게 몇 번 분할 마이그레이션 neuroblasts (세포) 또는 oligodendroblasts 3. prolif 새로 생성하는 다각적 neuroblasts는 세분화 및 차별화 된 억제의 interneurons으로 사구체 층에 통합 OB에 주동이의 철새 스트림 (RMS)을 형성, 전방으로 이동한다. 이주 젊은 oligodendroblasts는 로컬 분할 또는 성숙 myelinating의 희소 돌기 아교 세포 1,4로 분화 계속 미숙 NG2 양성 세포가 CC로 이동합니다.
태아 방사형 신경 교세포에서 파생 B1 세포는, 그들의 전임자의 연장 및 편광 형태를 유지하고 자신의 틈새 고도로 전문화 된 관계를 나타낸다. 그들은 어느 선 심실과 V-SVZ 틈새 시장을 관개 혈관의 네트워크까지 ependyma 사이에 걸쳐. 자신의 기초 과정은 나에이 틈새 결말을 관개 평면 혈관 신경 얼기에 접근하는 긴 거리를 확장하는 반면 multiciliated ependymocytes 중 B1 세포하게 인터의 작은 혀끝의 과정과는 단일 비 운동성이 차 섬모에 종료총 모세관 2,5-8의 ASAL의 얇은 판.
그대로 V-SVZ 틈새에도 GFAP + 아르 비 신경 인성 성상 세포,에서 B1-NSCs을 구별하는 가장 신뢰할 수있는 방법을 기반으로 한 후 3 차원 공 초점 현미경에 의한 심실 측벽의 준비 및 분석을 전체 마운트 GFAP에 대한 면역 염색은 세포막을 묘사하기 위해 얇은 B1-NSC 혀끝의 과정, β-catenin이 레이블, 각 섬모 5,8의 범위를 라벨을 cilial 기초 단체 또는 아세틸 화 α-튜 불린의 마커로 γ-tubulin의 하나입니다. 심실 표면에서 이러한 전체 마운트 관찰 B1과 뇌실막 세포는 하나 또는 여러 개의 GFAP + B1 셀의 uniciliated 혀끝의 프로세스가 multiciliated 뇌실막 세포의 장미에 의해 둘러 쌓여되는 "바람개비"5 배열되어 있음을 지적했다.
B1 세포의 특성 형태는 실험적 증거와 상관 관계 전NSCs의 2,6,9-11에 작용하는 수용성 신호의 조절 소스를 구성하며 그 혈관 / 내피 세포를 ndicating 및 뇌척수액 (CSF)를 심실. 심실 표면, 동형 및 뇌실막 및 B1 셀을 포함하는 이형 apico-측면의 상호 작용에 꽉 접합 및 adherens 접합 5,12-을 포함한다. 또한, 이러한 N 헤린 및 V-CAM 등 B1 및 뇌실막 세포 사이의 접합부 복합체에 관여 부착 분자는 V-SVZ 틈새 B1의 고도로 조직화 된 위치뿐만 아니라 조절하는 것으로 알려져 왔지만, 또한 정지 12 13. -B1 뇌실막 세포 단층은 확산 CSF로부터 물 및 작은 분자 조절 플럭스 배리어 허용하지만, 많은 단백질 10,11의 세포 간 통로를 제한하는 역할을 보인다. 실험 증거는 고유 위치 B1 셀 혀끝의 섬모가 CSF 2에 존재하는 폴리 펩타이드 신호의 센서로 역할을 할 수 있음을 나타냅니다5-7. 뇌실막 세포 자체, NSC 동작 14,15의 조절에서 역할 용해성 막 결합 신호 또한 소스이다.
예컨대 브로 모 우리 딘 (BrdU의) 또는 레트로 바이러스 뉴 클레오 시드가 추적 가능한 널리 생체에 포함 NSCs의 전구 세포를 라벨 사용되어왔다. BrdU의 신호가 반복 세포 분열 및 레트로 바이러스를 통해 희석 우선적으로 전달 (16, 17)에 대한 세포 증식 자신의 요구에 의한 세포를 증폭 일시적 대상으로 표시하기 때문에,이 방법은 장기간의 운명 추적을위한 최적되지 않습니다. 틈새 구성 요소와 상호 작용을 포함하여 생체 내에서 NSC의 생리를 조사하기 위해, 라벨 및 B1-NSCs을 크게 대기하고 자신의 주변 뇌실막 세포 생리 학적 조건 3에서 분할 결코로, 거의 구분되지 세포를 추적하는 방법을 설정하는 데 매우 중요합니다. 여기서는 렌티 바이러스 벡터 (정맥 주사)을 고효율 유전자 마크 있도록 보여ING와 능력 형질 도입하고 세포주기 독립적 인 방식으로 표적 세포의 게놈에 통합이 가장 합리적으로 인해 성인 NSCs의 비 분할 뇌실막 세포의 장기 수정. 또한, 우리는 배달 및 바이러스 역가 도움의 경로를 구체적으로하여 NSCs의 틈새 시장에 의존, 뇌실막 효과의 분석을 가능하게 B1 셀을 뇌실막 세포를 형질 도입,하지만하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
정맥 주사는 성인의 유전자 변형 NSCs의 16, 18에 대한 다른 바이러스 시스템에 비해 중요한 장점을 제공합니다. V-SVZ 틈새 시장에 렌티 바이러스의 정위 배달 레이블 만 세포를 대상으로 여러 세포 분열, 또는 레트로 바이러스 후 희석 등의 BrdU의 같은 다른 일반적으로 사용되는 방법의 한계를 극복 B1-NSCs을 나누어 자주 추적하는 효율적인 방법을 나타냅니다 즉, 응용 프로그램의 순간에 확?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 MJ 팔롭의 도움말 및 대학교 드 발렌시아의 SCSIE의 기술 지원을 인정합니다. 우리는 또한 도움이 의견과 원고의 논의 안토니아 Follenzi 감사합니다. 그 산탄데르 대학교 글로벌 사업부를 통해 방코 산탄데르에 의해 재단이 보틴,에 의해 Generalitat 발렌시아 (Programa PROMETEO, ACOMP 및 ISIC)과 Ministerio 드 Economìa y를 Competitividad에서 보조금을 지원하는 경우 (MINECO : SAF2011-23331, CIBERNED 및 RETIC 수컷 매) . 이 작품은 또한 (260511- MINECO과 유럽 연구위원회 (ERC) 2012-STG에서 BFU2010-21823 및 RETIC 수컷 매 보조금 지원 PD-HUMMODEL AC BM-P)이다. MINECO의 스페인 FPI의 교제를받는 사람이다.
Materials
| Part 1: Generation of LV for in vivo delivery. | |||
| Equipment: | |||
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XL-100K | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-28 | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-55 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 358126 | 25X89 mm |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | 13X51 mm |
| Ultracentrifuge adapters | Beckman Coulter | 358156 | |
| 6-well plate | SPL | PLC-30006 | |
| 24-well plate | SPL | PLC-30024 | |
| 10 cm dish | SPL | PLC-20101 | 100×20 style |
| FACS tubes | Afora | DE400800 | 12×75 mm, 5 ml |
| Cup sterile FACS filter | BD | 340626 | 30 µm |
| Nitrocellulose filter | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm |
| Flow cytometer | BD | LSR Fortessa | Blue laser 488 nm |
| Steritop filter | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 µm |
| Reagents: | |||
| pMDLg/pRRE plasmid | Addgene | #12251 | Core packaging plasmid |
| pRSV.REV plasmid | Addgene | #12253 | Core packaging plasmid |
| pMD2G plasmid | Addgene | #12259 | Envelope plasmid |
| pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid | Addgene | #12252 | Transfer vector plasmid |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowest | L0101-500 | For HeLa cell culture |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | For 293T cell culture |
| Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered | ||
| 2X HBS | 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530). | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X. |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100 | Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM. |
| Sodium pyruvate | Life technologies | 11360-039 | Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM. |
| GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water. |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | H9268 | Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O |
| Paraformaldehyde EM grade 16% | EM Sciences | 15710 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle. | |||
| Equipment: | |||
| Vernier stereotaxic instrument | NeuroLab, Leica | 39463001 | |
| Cunningham mouse and neonatal rat adaptor | NeuroLab, Leica | 39462950 | |
| Syringe holder | KD Scientific | KDS-311-CE | |
| 33-gauge syringe | Hamilton | P/N 84851/00 | #85RN |
| Electric drill | Fine Science Tool | 98096 | |
| Thermal blanket | Ufesa | AL5512/01 | 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01 |
| Shaver | Jata | MP373N | Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03. |
| Reagents: | |||
| Medetomidine | Esteve | DOMTOR | Comercial solution at 1 mg/ml. |
| Ketamine | Merial | Imalgene 500 | Comercial solution at 50 mg/ml |
| Medetomidina/ketamine mixture | Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight | ||
| Butorphanol | Pfizer | Torbugesic | Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution. |
| Atipamezole | Esteve | Antisedan | Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia. |
| 0.9% saline solution | Braun | 13465412 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | Topical skin adhesive |
| HydroGel | Clear H2O | 70-01-5022 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11×21 cm |
| Bleach/Virkon | Dupont | ||
| Surgical marker pen | Staedler | 313-9 | Permanent lumocolor |
| Ophthalmic lubricant | SICCAFLUID | 0.5 g/dosis, carbomer 974P | |
| Povidone-iodine | Betadine | 694109.6 | 10% povidone-iodine |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 3: Histological analysis. | |||
| Equipment: | |||
| Automatic peristaltic pump | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V |
| Pump head | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor |
| Silicone tube | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-96410-16 | Platinum L/S 16 |
| Scalp vein set | Vygon V-green | 70246.05T | 25G, 30 cm tube length |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Confocal microscope | Olympus | FluoView FV10i | |
| Hot plate | Tehtnica | SHP-10 | |
| Reagents: | |||
| Phosphate buffer (PB) | 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4 | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Panreac | 141451.1211 | Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB. |
| Saline solution | 0.9% NaCl in dH2O | ||
| Superglue | LOCTITE | 767547 | |
| Sodium azide | Panreac | 122712.1608 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100 | |
| Normal goat serum | Millipore | S30-100 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Detergent |
| Anti-GFP rabbit antibody | ROCKLAND | 600-401-215 | Use at a 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular probes | A-21206 | Use at a 1:750 dilution |
| 6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C. |
| Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | Mounting medium for fluorescent preparations |
Referencias
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).
- Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone. Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).
- Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).
- Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. (39), (2010).
- Ramirez-Castillejo, C., et al. Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal. Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).
- Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow!. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Delgado, A. C., et al. Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction. Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).
- Kokovay, E., et al. VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression. Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).
- Porlan, E., et al. MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin. Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).
- Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain. Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).
- Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone. Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).
- Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. In vivo targeting of subventricular zone astrocytes. Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).
- Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).
- Consiglio, A., et al. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).
- Dull, T., et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Bomsel, M., Alfsen, A. Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).
- Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine. J Biomed Biotechnol. , (2010).
- Bonazzi, M., Cossart, P. Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection. J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).
- Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer. PLoS One. 8 (11), (2013).
- Yamashita, T., et al. Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
