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Biología

Mapeamento espacial e temporal da motilidade em<em> Ex Vivo</em> Preparações dos intestinos

Published: January 27, 2016
doi:
10.3791/53263
, ,
1Department of Physiology and Biophysics,Virginia Commonwealth University, 2Department of Biology,Loyola University Maryland

Summary

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Abstract

Várias abordagens têm sido usados ​​para registrar e avaliar a motilidade gastrointestinal, incluindo: o registo de alterações da tensão muscular, pressão intraluminal, e potencial de membrana. Todas estas abordagens depender de medição de actividade em um ou vários locais ao longo do intestino, simultaneamente, que são então interpretados para proporcionar uma sensação de padrões gerais de motilidade. Recentemente, o desenvolvimento de gravação de vídeo e mapeamento de espaço-temporal (stmap) técnicas tornaram possível observar e analisar padrões complexos em ex vivo segmentos inteiros de cólon e intestino. Uma vez digitalizada e gravada, registos de vídeo pode ser convertido para STmaps em que o diâmetro luminal é convertida em tons de cinza ou [mapas diâmetro chamado (Dmaps)] cor. STmaps pode fornecer dados sobre direção motilidade (ou seja, estacionário, peristáltica, antiperistáltica), velocidade, duração, frequência e força de padrões de motilidade contrátil. As vantagens desta abordagem incluem: analysis de interação ou desenvolvimento simultâneo de diferentes padrões de motilidade em diferentes regiões de um mesmo segmento, a visualização do padrão de motilidade muda ao longo do tempo, e análise de como a atividade em uma região influências atividade em outra região. As gravações de vídeo podem ser reproduzidos com diferentes prazos e parâmetros de análise a fim de que STmaps separados e padrões de motilidade podem ser analisados ​​com mais detalhes. Este protocolo detalhes especificamente os efeitos da distensão fluido e intraluminais estímulos intraluminais que afetam a geração de motilidade. O uso de agonistas de receptores de antagonistas luminais e fornece informações sobre a forma como mecanicista específica padrões são iniciadas e como um padrão pode ser convertido em um outro padrão. A técnica é limitada pela capacidade de medir unicamente a motilidade que provoca alterações no diâmetro luminal, sem fornecer dados sobre as alterações de pressão intraluminal ou tensão muscular, e pela geração de artefactos com base na configuração experimental; embora, analysis métodos podem ser responsáveis ​​por estas questões. Quando comparado com as técnicas anteriores, a gravação de vídeo e abordagem stmap proporciona uma compreensão mais abrangente da motilidade gastrointestinal.

Introduction

Vários métodos de gravação e análise de motilidade intestinal têm sido desenvolvidos ao longo dos últimos 150 anos 1. Estes vão desde a inicial in vivo observações e descrições de William Beaumont e de Walter Cannon com os métodos mais recentes de medição e interpretação de gravação multisite de tensão muscular, pressão intraluminal, e / ou potencial de membrana (ou seja, os potenciais de junção) 2 – 6. Estas últimas abordagens fornecem uma visão global dos padrões de motilidade, mas está limitado pelo número de sítios de gravação e a validade da interpolação dos dados para as áreas entre os locais de gravação.

O desenvolvimento recente de gravação de vídeo e mapeamento de espaço-temporal (stmap) técnicas tornaram possível observar e analisar padrões de motilidade complexos em ex vivo segmentos inteiros de cólon e intestino. Abordagens iniciais, primeiramente descrita por INTESTiNAl segmentos no final de 1990, 7,8 dependiam de software projetado-investigador para analisar a gravação de vídeo; vários grupos já criados ou modificados software para esta finalidade 2,8 – 12. Enquanto que muitos grupos têm gerado seus próprios pacotes de software ou plug-ins, todos eles analisam diâmetros de um segmento de tecidos e converter esses vários diâmetros de representação em tons de cinza. Um sistema de registo e análise disponível comercialmente chamado de sistema de monitoramento Motilidade Gastrointestinal (GIMM) fornece uma abordagem completa que permite a análise de ambos motilidade propulsora via fecal determinação da velocidade da pelota na cobaia cólon distal 13, bem como análise de padrões de motilidade propulsora e mistura com um estímulo líquido nos segmentos intestinais intactas 4,5,14 – 19. Esta última abordagem depende da geração e análise de STmaps e é descrito neste trabalho. O objectivo deste método é aumentar tele capacidade de analisar quantitativamente e qualitativamente diferentes padrões de motilidade presentes no intestino. Enquanto outros grupos têm usado a stmap para análise motilidade através de seu próprio software, esta é a primeira descrição de como usar o GIMM para analisar os padrões de motilidade pela geração de STmaps. No presente trabalho, nós fornecemos instruções detalhadas passo-a-passo sobre: ​​a preparação de tecidos do intestino para a gravação de vídeo, ajuste apropriado dos parâmetros de gravação de vídeo para maximizar a capacidade de detectar alterações no diâmetro do tecido, a criação de STmaps, bem como a interpretação e análise dos STmaps que utilizam o sistema GIMM e software ImageJ.

O método aqui descrito é específico para análise da perfusão luminal de líquidos ou semi-sólidos que contêm compostos que afectam os padrões de motilidade intestinal. Um método para análise de propulsão sedimento fecal é descrito num artigo de Mawe e colegas 13. O método geral aqui descrito pode seraplicado a outros órgãos tubulares do músculo liso, tais como: o intestino delgado, os vasos sanguíneos, uretra, ureteres, etc. Embora este método por si próprio não proporciona dados sobre as alterações na pressão ou tensão muscular, pode ser acoplado com a utilização de pressão transdutores, transdutores de força ou medições eletrofisiológicas para fornecer um quadro mais completo dos padrões de motilidade como alguns outros grupos têm demonstrado 2,15,20,21.

Protocol

Cuidado e Uso Comitê animal Institucional da Virginia Commonwealth University (IACUC) aprovou todos os animais e os procedimentos de eutanásia utilizados neste protocolo. 1. Preparação de Soluções Prepare a 4 L de tampão de Krebs (composto de [em mm]: NaCl 118, KCl 4,75, 1,19 KH 2 PO 4, 1,2 MgSO4, 2,54 de CaCl2, 25 de NaHCO3, 11 de glucose). Pesar as quantidades apropriadas de cada produto químico sólido, colocado no volume apropriado de água desionizada e misturar utilizando um vortex até que a solução fique límpida. Em seguida, arejar a solução com carboxygen (95% de O2, 5% de CO 2) durante 30 minutos enquanto se aquece até 37 ° C. Determinar o pH da solução ao mesmo tempo a 37 ° C (à mesma temperatura que no banho de órgãos) e ajustar para pH 7,4, se necessário, utilizando HCl. Manter o tampão de Krebs continuamente carboxygenated e a 37 ° C durante toda a duração da experiência. Colocara entrada e saída dos tubos de bombas peristálticas para o reservatório tampão e por sua vez sobre as bombas peristálticas para começar a perfusão do tampão ao longo do sistema de tubagem e de banho de órgãos. NOTA: tampão pode ser inicialmente bombeada de volta para o recipiente original até a adição de ambos os tecidos em banhos de órgãos ou os produtos químicos no tampão de perfusão. Isto reduz a quantidade total de tampão necessária para a experimentação. Em seguida, as linhas de perfusão de saída-tampão deve ser colocado em um recipiente vazio para que os buffers ingoing e saída não se misturam. Calibrar a temperatura do sistema de aquecimento em banho de circulação, de modo que o tampão dentro dos banhos de órgão torna-se e permanece 37,0 ± 0,5 ° C durante a duração da experiência. Confirmar e modificar, se necessário, o pH do tampão de Krebs, pelo menos, mais uma vez, antes de colocar os segmentos de tecidos no banho no passo 2.8. 2. Preparação de Tecidos Euthanizeuma cobaia por uso de dióxido de carbono por inalação / asfixia em uma câmara selada ou outro método de eutanásia aprovado pelo comitê de cuidados com os animais e uso local. Após a confirmação da eutanásia do animal, cortar a parede abdominal aberta longitudinalmente com tesouras de dissecação e localizar os intestinos. Cortar o mesentério associado para o intestino delgado para ajudar a expor o ceco. NOTA: Para confirmar a eutanásia realizar um procedimento secundário, como toracotomia bilateral aprovado por um comitê de cuidados com os animais e uso. Localizar a extremidade distal do ceco e cólon proximal transecção imediatamente distai à sua conexão com o ceco. Então transecto do cólon proximal novamente ~ 8 cm distal à primeira transection. Coloque o tecido do cólon em solução Krebs aquecido e carboxygenated (descrito no capítulo 1) para mais dissecção. Pin do cólon para o banho de dissecção e usar um conjunto mais pequeno de uma tesoura para remover a maior quantidade de gordura e mesentério quanto possível. No htabuleiro de dissecação eated, remover todo o conteúdo intraluminal suavemente por perfusão de tampão de Krebs através do lúmen, utilizando uma seringa ligada a um cateter de ponta romba (para ajudar a impedir a perfuração do tecido). Evitar o excesso de distensão do segmento durante este processo de perfusão. Obter dois cateteres tubo de vidro polido ao fogo (3 mm de diâmetro) e colocar uma peça curta de tubulação de polietileno (~ diâmetro 3 mm de comprimento e 3 mm ~) em torno da porção do tubo de vidro que entra no lúmen de tecido. NOTA: Este vai permitir que o fio de sutura para ser colocado em torno do tubo de vidro tecido e permanecer segura e não escorregar como a preparação é colocado no banho de órgãos e durante as mudanças de comprimento do tecido. Inserir um cateter na extremidade bucal de preparação de tecido e um laço de sutura em volta do pequeno pedaço de tubo em torno do cateter utilizando um nó do cirurgião. Gentilmente tentar puxar o cateter de volta para garantir o nó é confortável. Em seguida, executar a mesma ação no outro t cateter entrarele extremidade aboral do tecido. Uma vez que os cateteres são garantidos, mover-se toda a preparação (tecido mais cateteres) do tabuleiro de dissecação em um dos banhos de órgãos. Coloque a preparação para o banho com o fim oral, virada para fora a partir do utilizador. Próximo montagem / proteger os cateteres de tubo de vidro para o banho do órgão por um dos dois métodos sugeridos. NOTA: Protegendo o vidro tubos de impedir que o segmento de tecido de alterar o comprimento durante o experimento ou vindo acima do nível da superfície do tampão de Krebs no banho. Opção A: fixar a porção superior do tubo de vidro para a parte superior do lado do banho de órgãos de plástico através do uso de argila do moldador ou um grampo de plástico. Opção B: Prenda os tubos de vidro para os pólos metal que prendem as câmeras acima da preparação banho de órgãos através da utilização de braçadeiras de plástico. Uma vez que os cateteres são fixados ao banho, anexar um pedaço de 5 cm de tubo na extremidade aberta de cada cateter. Para o gato bucalheter, anexar este tubo a uma seringa de 10 ml, que será utilizado para injectar tampão para o lúmen do segmento do cólon proximal. Para o cateter aboral, este pedaço de tubo irá permitir o escoamento luminal para ser dirigido para um recipiente de recolha (copo de 50 ml, reservatório, etc). Usando a seringa ligada à extremidade bucal, rubor lentamente aquecida tampão de Krebs através do lúmen de tecido para garantir que o líquido pode fluir através do tecido. Fluxo é confirmada por o líquido que sai do cateter aboral. Calibrar o sistema de gravação de vídeo (seção de protocolo 3) enquanto o tecido se equilibra para 30 min. 3. Calibração de vídeo-gravação do sistema Calibrar a colocação altura da câmera, as configurações de vídeo de brilho e contraste, e distância horizontal usando o software. NOTA: Os melhores definições para configurações de perfusão intraluminais são diferentes do que as configurações usadas para determinar a velocidade de propulsão pellet 13. Click na guia experimento para a câmara seja calibrada. Em seguida, no menu 'File' clique 'calibrar'. Depois que o vídeo aparece na janela 'calibrar estação de trabalho', defina a câmara a uma altura em que a imagem inclui as extremidades dos cateteres inseridos no lúmen do cólon. Em seguida, calibrar a distância horizontal visto na imagem usando o adesivo governante translúcido ligado a cada banho. NOTA: Esta calibração é crucial para cálculos de software posteriores do diâmetro luminal e velocidade das ondas contráteis. Na mesma janela 'calibrar estação de trabalho', defina as diretrizes verticais vermelhas de modo que eles são de 10 mm entre si de acordo com o governante na imagem da câmara. Em seguida, digite a distância adequada (10 mm) para a janela 'cursores distância' e clique no botão "CAL". Em seguida, ajustar o ganho, brilho e obturador sliders dentro da janela 'calibrar estação de trabalho' para modificar a imagem da câmera para queo segmento de tecido aparece como uma silhueta escura sobre um fundo claro. NOTA: A Figura 4 mostra bons e maus exemplos deste procedimento de calibração. Para ajustar corretamente a imagem, também ajustar o foco e abertura botões na própria câmera. A calibração está agora concluída. Clique em "Salvar" e clique em "OK" no pop-up, e, finalmente, clique no botão "Sair". 4. Procedimentos experimentais gerais Após os procedimentos de calibração de câmeras e 30 min de equilibração tecido são completos, nomear os ensaios em cada protocolo experimental. Nomes de teste pode ser baseado no nome e da concentração do composto e do volume de líquido a ser perfundido intraluminalmente no segmento de tecido durante a porção do experimento. Em seguida, obstruir o tubo saliente para fora do cateter aboral através da utilização de uma braçadeira de tubos. NOTA: Este impede que o líquido luminal de sair no final aboral durante fuexperimentação rther, permitindo a utilização de volumes específicos no lúmen para provocar vários níveis de distensão (Figura 1). Injectar aproximadamente 0,7 ml de tampão de Krebs no lúmen do cólon proximal para fornecer distensão suficiente para iniciar a contracções propulsivas na cobaia preparação ex vivo. NOTA: Este volume pode variar ligeiramente (0,1 – 0,2 mL), dependendo do comprimento total do segmento intacto e a quantidade de esticamento aplicada ao segmento no banho de órgãos. Uma vez que o segmento é distendido por fluido luminal, ligar a câmera e, em seguida, registrar a motilidade por um período pré-determinado de tempo (por exemplo, 10 min). Especificamente, clique duas vezes no julgamento apropriadamente chamado para abrir a visualização da câmera experimental e, em seguida, clique no interruptor para a posição "ON" para visualizar o campo da câmera. Em seguida, clique no botão de gravação para iniciar a gravação (botão de gravação permanecerá vermelho enquanto a câmera está gravando) umnd clique no botão de gravação para parar a gravação. No final deste estudo de controlo inicial a distensão, soltar / remover o grampo de oclusão do cateter aboral para permitir que o segmento de tecido para impelir o líquido para fora de distensão do lúmen. Depois de um período de re-equilíbrio de 10 minutos, repetir este procedimento com qualquer um de uma variedade de nutrientes, agentes bioactivos, fármacos, ou agonistas / antagonistas do fluido luminal para modificar a motilidade propulsora do segmento (por exemplo, ácidos gordos de cadeia curta ou decanóico ácido) 10,18. Para ajudar a identificar quando é que o novo fluido experimental entra no segmento do cólon, deixar uma bolha de ar na proximidade da porta da seringa de modo que após a perfusão da nova solução para o colónica lúmen o progresso da bolha irá permitir ao utilizador saber quando o fluido experimental atingiu o lúmen. Continue perfusão intraluminal com o cateter aboral aberto até que a bolha foi empurrado completamente através dosistema de perfusão luminal (pode exigir 2-3 ml de perfusato). Em seguida, permitir que o segmento de tecido para expelir o fluido através do cateter aboral aberto até 5 min. NOTA: Após este procedimento, o lúmen conterá um volume desprezável de fluido, permitindo a perfusão de um volume conhecido de líquido para dentro do lúmen. Re-oclusão do tubo de cateter luminal aboral utilizando uma braçadeira de tubagem (como no passo 4.3) injectar o mesmo volume de fluido de distensão como na condição de controlo através da seringa. Registam-se os padrões de motilidade durante o período experimental para posterior análise e comparação com a condição de Krebs controlo (tal como no passo 4.5). Repetir secções 4.4 – 4.7 do protocolo com diferentes compostos luminais ou concentrações diferentes do mesmo composto luminal. 5. Construção de espaço-temporal Mapas (STmaps) Após a conclusão da gravação do experimento, clique duas vezes no nome de um estudo específico para abrir o vento análiseow para a construção de um stmap. Dentro da área de reprodução de vídeo, ajuste os controles deslizantes de brilho e contraste na janela de análise para fazer a imagem apropriada para análise (silhueta tecido preto sobre fundo claro; Figura 4). NOTA: Se a câmara de calibragem não foi executada de forma apropriada antes de começar a experiência, a imagem só pode ser modificado para um menor grau neste ponto. Depois que a imagem é contrastada corretamente, defina as diretrizes vermelhas horizontais e verticais dentro da janela de imagem de vídeo para isolar a região de tecido para análise e remover áreas contendo artefatos. Além disso, selecione o segmento de tempo apropriado a partir da gravação, determinando o início e parar pontos de tempo para análise. Especificamente, selecione a pontos inicial e final no vídeo usando o amarelo botões 'B' verde 'A' e no software de análise. Ajuste o regulador de tempo para o início do segmento de vídeo e para analisar on clique no botão 'A' verde. Em seguida, defina o controle deslizante para o final do segmento para analisar e clique no botão amarelo 'B'. Em seguida, clique na guia "análise do motor 'para abrir a janela stmap e clique no botão' cronômetro '. Depois de clicar no cronômetro, próximo clique no cursor de mira dentro da silhueta preta do tecido dentro do filme gravado para começar a geração stmap. Depois de clicar em mira a silhueta tecido, o software gera e exibe o stmap para aquela região do vídeo. NOTA: Isso pode demorar alguns minutos, dependendo do comprimento do vídeo selecionado para análise. Clique em 'zoom' para ver uma imagem ampliada do stmap e controles para ajustar a imagem. Clique na opção "cor" na janela recém-criado para exibir o stmap como a cor em vez de escala de cinza. Além disso, clique na opção "Ativar" para ser capaz de posicionar um cursor em pixels específicos dentro do mapa e view um traçado da mudança no diâmetro luminal para que a região específica de tecido. Clique em 'Sair' quando terminar. Exportar uma stmap para uso em documentos ou apresentações ou aprofundar a análise em ImageJ, selecionando o menu 'File', seguido por selecionar 'Exportar Dados' e depois 'Meta File'. Nomeie o stmap, que será guardada como um arquivo .emf e clique no botão "Salvar". Como alternativa, salvar imagens do stmap por capturar um screenshot. Isso é necessário para salvar versões pseudo-cores do stmap. 6. Análise de contrátil onda de velocidade em STmaps Para analisar a velocidade de propagação contrátil ou duração de contração, primeiro converta o arquivo stmap .emf para .tiff, .gif, .jpg, ou formatos .bmp que sejam aceitáveis ​​para ImageJ através de um programa de conversão de arquivos de escolha. NOTA: O ImageJ não abrir a saída formato .emf dos STmaps do software. AlternativEly, o uso de software de captura de tela para tirar uma foto de um stmap na tela e salvá-lo em um formato de arquivo adequado. Em seguida, abra o stmap re-formatado em ImageJ e abra o plugin GIMMProcessor abrindo o 'menu e selecionando' "Plugins GIMMProcessor '. Isto irá abrir duas' janelas GIMMProcessor 'e' medidas da tabela '. Clique no botão "ferramenta de seleção retangular" dentro da janela de ImageJ e, em seguida, usá-lo para delinear clicando e arrastando toda a área da barra de escala no canto superior direito da stmap. Depois que a região é selecionada, clique no botão 'conjunto de calibragem "no plugin. Finalmente, inserir a distância adequada (mm) e o tempo (seg) na caixa de calibração de acordo com os valores na barra de escala e clique "Done '. Em seguida, clique na ferramenta de desenho de linha na janela do ImageJ. Desenhar uma linha na stmap através do centro de uma contracção de propagação ao longo do ângulo de the inclinação clicando e arrastando na imagem stmap. Como alternativa, desenhar uma linha vertical através de uma banda de contração não-propagação para determinar a duração de contração. Após a linha é desenhada de forma adequada (apenas uma linha pode ser tirada de cada vez), clique no botão "tomar medida 'no plug-in para gerar um ler-out da distância horizontal, distância vertical e inclinação da linha; o que corresponde ao comprimento (mm), o tempo (seg), e a velocidade (mm / s), respectivamente. Estes dados são apresentados na janela 'Medidas Table'. Repita o desenho e análise passos várias vezes dentro de um determinado stmap e salvar os dados como um arquivo .gmd. Clique no botão "Salvar" no plugin e nomeie o arquivo. Em seguida, clique em "Salvar" novamente para concluir o processo. Estes dados podem depois ser comparado com outros dados de ensaios ou usada para re-desenhar linhas em um stmap.

Representative Results

Entendendo espaço-temporal Mapas (STmaps) como diâmetro Maps (Dmaps) Enquanto os mapas gerados por esta técnica são espaço-temporal, alteração no diâmetro luminal do tecido é o parâmetro especificamente visualizado tanto em distância e tempo. O stmap retrata distância horizontal ao longo do segmento de tecido no eixo x (em mm) e o tempo no eixo y (em seg) com o tempo a partir da hora de topo e terminando na parte inferior. No canto superior direito é uma lenda, que exibe diâmetros mínimos e máximos luminais, além da expansão tanto para o x e y-eixos (Figuras 1-4). Assim, diferentes tons de pixels dentro da imagem em tons de cinza correspondem a diferentes diâmetros luminais. Pixels mais escuros correspondem a diâmetros mais largos e mais leves pixels correspondem a diâmetros menores. Assim, as ondas contrácteis do músculo circular aparece como regiões de pixelação isqueiro devido à redução do diâmetro luminal ( <strong> Figura 1 setas pretas). Em contraste, a distensão luminal devido ao relaxamento do músculo circular ou um grande bolus de fluido vai causar um aumento no diâmetro luminal e pixels mais escuros nos (setas brancas Figura 1C) stmap / DMAP. Uma outra discussão sobre a formação eo significado da STmaps pode ser encontrada em um artigo de grupo Lammers 11. Luminal Distensão-Induzidas Propagação Contrações Na Figura 1, cobaia cólon proximal foi distendido com 0,5, 1,0, 1,5, e 2,0 ml de tampão de Krebs durante 5 minutos a cada volume. Propagação de contracções foram induzidos por todos os volumes ≥1.0 ml e aparecem como bandas brancas finas no stmap (Figura 1). Distensão do lúmen intestinal provoca o início das contrações propagação. Como mostrado na Figura 1, o diâmetro do lúmen aumenta com maiores volumes intraluminais e os pixels na stmapcorrespondente ao diâmetro ficar mais escura que cria um fundo global mais escura. Em algum grau de distensão do reflexo peristáltico é activado (1,0 ml; Figura 1), o que inicia ondas propulsivas de contracção no final por via oral que diminuem o diâmetro do lúmen e se movem para a extremidade anal do segmento (mostrado como uma faixas brancas nas Figuras 1 e 4). A banda representando branco contracção é muitas vezes precedido por uma banda escura, que representa o relaxamento aboral à frente da onda peristáltica (setas brancas Figura 1C). Estes pixels brancos e escuros correspondem à contração ascendentes e descendentes componentes de relaxamento do reflexo peristáltico, respectivamente 22,23. No stmap na Figura 1 painel A, existem 0 ondas de propulsão em 0,0 ml, 0 ondas de propulsão em 0.5 ml distensão, 3 ondas de propulsão a 1,0 ml distensão, 6 ondas de propulsão em 1.5 ml distensão, e 5 ondas de propulsão umt 2.0 ml distensão. Stationary / mistura as contrações induzidas em nutrientes Ondas de contração de propagação que não são o único padrão de motilidade que pode ser visualizado por STmaps. Mistura de padrões de motilidade, tais como a segmentação também pode ser visto na STmaps e a correspondente imagem (Figura 2A). Este padrão é diferente do que as contrações propagação. Durante a mistura padrões de muitos pequenos, contrações estacionárias ocorrem em áreas diferentes ao mesmo tempo (visualizado como vários pequenos quadrados brancos na mesma linha horizontal, mas não tocar uns aos outros). Enquanto cada contração segmentar é estacionário e não se move na fase oral de modo anal como descrito por contracções de propagação, a capacidade de os STmaps para ilustrar os padrões contrácteis complexos ao longo de períodos de tempo longos permite a visualização da progressão lenta das contracções analmente ao longo do tempo (Figura 2A seta preta). A duraçãocada contração indivíduo também pode ser determinada por desenhar uma linha vertical através do quadrado branco contração usando ImageJ eo plugin associada (Figura 2A). Neste stmap especial gerado a partir de perfusão intra-colônica de ácidos graxos de cadeia curta, a duração média de contração estacionário é de aproximadamente 2 segundos (intervalo: 1,9 a 2,1 seg). Enquanto mesentério restante em um segmento de tecido pode causar artefactos em análise, os artefactos gerados por linhas verticais mesentério (Figuras 1B, 2B) pode ser usado para determinar os movimentos musculares longitudinais. Nas Figuras 1B e 2B o movimento horizontal da linha vertical preto é devido a contracção e relaxamento do músculo longitudinal. Este movimento lateral do músculo longitudinal pode ser visualizado no STmaps como movimentos horizontais das bandas verticais geradas por artefactos mesentério (Figuras 1B, 2B). ImageJ e PlugiN Análise de STmaps Tanto a velocidade de uma onda de propagação (Figura 3), bem como duração da contracção (Figura 2) pode ser determinada utilizando o ImageJ e o plug-in GIMMProcessor. Na Figura 3, a velocidade de propagação de ondas tanto orthograde e retrógrada foi ~ 0,25 mm / s (intervalo: 0,21 para 0,35 mm / seg). Como pode ser visto na imagem de vídeo por cima do mapa em ST, as linhas de análise (linhas vermelhas que formam uma caixa na imagem de vídeo) foram definidos com precisão em torno de uma extremidade do segmento de tecido em vez de em torno de todo o segmento. Este é um uso importante das orientações do software. Definição precisa destas orientações é fundamental para a adequada análise do vídeo como ainda analisados ​​na seção de discussão. Isso permite a geração de um stmap que visualiza contrações ondulação miog�icas 24. Essas contrações são miogênica na origem e não mudam diâmetro luminal muito. Além disso, dir diferenteexões de propagação (orthograde ou retrógrada), que são comuns para ondulações, pode ser analisada usando esta técnica (Figura 3). Como mostrado na Figura 2, a duração da contracção pode variar em diferentes regiões do segmento de tecido. Análise adequada de STmaps Um potencial problema com a criação de STmaps é possível geração de artefato devido à metodologia experimental. Por exemplo, mesentério deixado do lado de fora do tecido irá aumentar o diâmetro do segmento de leitura para que o tecido de criação de uma linha vertical na stmap (Figuras 1, 2B). A presença de mesentério também alarga artificialmente o mapa em escala de cinza, aumentando a medida mais ampla do lúmen, o que resulta em um embotamento das medições de contraste de escala. Por esta razão é melhor para remover o mesentério tão completamente quanto possível a partir do segmento sem perfurar o tecido. Um outro artefacto stmap possível é uma linha vertical devido a bolhas dentro do fluido luminal que não pode ser contrastado com negro (Figura 4B). Estas bolhas podem tornar o diâmetro luminal parecem menores para o software de análise de sobreposição ou regiões / luz branca na padrões de motilidade no stmap. Portanto, a configuração do segmento de tecidos e bom contraste da gravação de vídeo antes da análise são absolutamente cruciais para o sucesso na construção STmaps (Figura 4). Setups contrastantes próprios e impróprios são mostrados na Figura 4. É importante notar que o ajuste de vídeo, tanto no pré-experimento calibração da câmara e janela de análise pós-experimento são cruciais para a geração stmap adequada e análise. Calibração da imagem inadequada pode levar a STmaps com dados inutilizáveis ​​(Figura 4A). 700 "/> Figura 1. ondas de propagação no cólon proximal. (A) Uma curva de resposta à distensão (realizado em cobaia cólon proximal) foi usado para determinar o volume de fluido intraluminal adequado iniciar ondas de propagação, neste segmento horizontal (bandas brancas). Setas pretas ilustram exemplos de ondas de propagação de comprimento completo. As setas brancas ilustram o artefato linha causada pela remoção mesentério incompleto. (B) Uma visão mais próxima das contrações alcançados pela geração stmap de um experimento semelhante ao Painel A propagação, mas um vídeo de duração mais curta. É mais fácil observar que as contrações progredir no sentido oral ao anal e identificar o relaxamento aboral anterior representada como uma área escura à frente da faixa branca em comparação com o painel A. O mapa também fornece outra visão de artefatos mesentério. A caixa vermelha identifica a região deste stmap expandido no painel C. (C) Este painel ilustra uma vista ainda mais perto of o mesmo vídeo e mapa como no painel B. setas brancas marcadas ponto 'Distensão Fluid' para pixels escuros que são devido a distensão luminal por fluido aboral à onda de propagação. São regiões onde o relaxamento muscular circular ocorre aboral à contração muscular circular. Note-se que as contrações se propagam olhar como linhas completamente horizontais em painel A, devido ao longo prazo do mapa. Em painéis B e C o tempo escalas são progressivamente mais curtos para que a onda contrátil tem uma inclinação que pode ser medido e indicado como a velocidade do movimento das ondas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Determinação da contração Duração por stmap. (A) Cobaia proximal sh cólonuxos um padrão de motilidade mistura / segmentar em resposta à perfusão intraluminal de ácido graxo de cadeia curta (butirato). Linhas vermelhas verticais foram tiradas através dos períodos de contração para determinar a duração de contração de utilizar o Image J e do plugin GIMMProcessor. A seta preta mostra a direção aboral de propagação das contrações estacionárias. (B) propagar contrações em rato íleo mostram frequentemente regiões de contração sustentada. Setas verticais desenhado no mapa mostra que as regiões mais orais permaneceu contratado por um período mais longo. Nesta preparação, a fim anal da preparação foi fechada para impedir que o fluido de sair do sistema fechado durante as contracções dos tecidos. A imagem na parte superior do painel mostra um momento em que a totalidade do dente oral do tecido é contraída (branco em stmap), enquanto que a totalidade do anal é distendido por fluido (preto no stmap). O movimento horizontal / lateral do preto vertical no meio do painel B mostra stmap do movimentocamada muscular longitudinal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. Patterns Bi-direcional da Motilidade. Propagando ondas podem se mover em ambos orthograde (oral para anal) e retrógrada (anal para oral) direções. Setas pretas sólidas mostram propagação orthograde normal e setas pretas tracejadas mostram propagação retrógrada. A velocidade de propagação de ambos orthograde e contracções retrógradas neste stmap foram determinados por análise ImageJ e foram ~ 0,25 mm / seg. Linhas de análise de imagem (linhas vermelhas que dão forma a uma caixa de imagem de vídeo acima da stmap on) foram criados perto de uma borda do tecido para visualizar contrações ondulação miogênicos que são de baixa amplitude, contrações rasas, muitas vezes orientados em orthograde, retrograde, ou ambas as direções. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Importância do contraste de imagem adequada para stmap Generation. (A) mostra uma imagem contrastada de forma inadequada e stmap, enquanto que o painel B mostra uma imagem contrastada e adequadamente stmap. Em (A) as faixas brancas horizontais geradas a partir da imagem devidamente contrastado (B) não são tão óbvias e há vários artefatos (sombreamento branco), devido à imagem inicial estar em tons de cinza. No stmap gerado a partir da imagem contrasta adequadamente (B) os artefactos de sombreamento brancas da escala de cinzentos desaparecer e as ondas de propagação são mais pronunciados. Além disso, o sombreado preto representando relaxamento ahEAD da onda de propagação contráctil pode ser visto no final do anal stmap com cada onda de contracção. No painel B as setas brancas mostram um artefacto stmap gerado por uma região da imagem que não poderiam ser correctamente contrastado. Este tipo de artefato é na maior parte devido a bolhas intraluminais que ocasionalmente ocorrem na preparação durante o curso do protocolo experimental. 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Discussion

Motilidade intestinal foi visto e descrito a partir de um número de perspectivas com base na natureza dos parâmetros a ser gravados. A gravação de vídeo e mapeamento espaço-temporal provou uma ferramenta valiosa que permite a análise de movimento global e / ou propulsão durante longos segmentos do intestino, bem como a análise da actividade em pontos específicos ao longo do segmento. A abordagem adotada para gravação de vídeo e mapeamento de espaço-temporal pode ser dupla e é o reflexo da região examinados e à natureza dos conteúdos luminais. Em segmentos intestinais conteúdo luminal onde são mais fluidas e, cólon proximal onde os conteúdos estão mais semi-sólido, a actividade é induzida pela introdução de fluido intraluminal por bolus ou infusão. Mapas de espaço-temporais feitos a partir destes registos de vídeo se destinam a representar o movimento de todo o segmento, tal como descrito acima. Em contraste, em meados da década de cólon distai onde os conteúdos estão mais sólida, a actividade é iniciada através da inserção de um Pelle fecalt (pelete revestida com epoxi naturais ou artificiais sedimento) e mapas de espaço-temporais são concebidos de modo a reflectir o movimento do sedimento através do cólon, tal como ilustrado no artigo JOVE de Hoffman et ai. 13. Assim, a configuração da experiência e a análise são cruciais e dependem do tipo de estímulo e a região a ser estudada. Por conseguinte, os passos críticos para a geração e análise de mapas de espaço-temporais motilidade intestinal induzida por fluido são: 1) a remoção adequada do mesentério dissecados a partir do tecido; 2) calibração imagem adequada antes da gravação; 3) adequada remoção de artefatos durante a geração e análise stmap; 4) a configuração adequada do sistema de análise; e 5) a ganhar a destreza manual para catheterize e suturar os segmentos sem danificá-los.

Enquanto o uso de STmaps de diâmetro luminal melhoraram a capacidade de visualizar e analisar padrões de motilidade cheia sobre uma região do intestino, a técnica é mais utilizado quando acoplado commedidas funcionais de pressão ou contração muscular 2,15,20. Por exemplo, enquanto algumas contrações musculares podem alterar diâmetro luminal ligeiramente e ficará visível em alguns STmaps (ou seja, ondinhas miogênicas) eles não podem realmente causar qualquer propulsão ou de mistura de conteúdo intestinal 25. Isso não pode ser conhecido sem acoplamento desta técnica para outras medidas funcionais. Além disso, a natureza de muitas preparações de tecido, neste tipo de sistema (isto é, um sistema fechado luminal ou luminal de perfusão constante por um sistema de bomba) leva a artefactos dentro STmaps. Assim, o usuário deve estar ciente de como a sua preparação órgão específico e experiência pode levar a artefatos nos dados e formas de evitar ou excluir esses artefatos na análise de dados (por exemplo, linhas verticais induzida por mesentério ou pixelation escuro devido à incapacidade do tecido de expelir o fluido a partir do sistema numa preparação luminal fechado). Existem vários métodos para a perfusão do lúmen de um intato segmento intestinal, além de um sistema fechado. Um método consiste em utilizar, em vez de um sistema aberto que mantém uma constante intraluminal / contra-pressão por meio da utilização de um tubo levantada e / ou válvula de uma via na extremidade da preparação Anal 8-10,30. Isso permite que o fluido se mover para fora da preparação durante as contracções propulsivas.

Como o sistema está configurado principalmente para detectar alterações no diâmetro luminal, essas contrações ou padrões de motilidade que não afetam grandemente diâmetro luminal são muitas vezes difíceis de visualizar por este protocolo. Uma vez que mudanças no sombreamento de pixel dentro do stmap são baseados em alterações no diâmetro luminal, os padrões de motilidade que não causam grandes mudanças de diâmetro não será visualizado bem neste método se as contracções fortes também estão presentes dentro da mesma gravação. Como descrito para a visualização e análise de tipo ondulação contração (Figura 3), que estabelece as linhas de análise na gravação de vídeo mais perto to muro do tecido pode evitar este problema. Este método reduz o diâmetro máximo apresentado na stmap, de modo que apenas minimamente contracções troca de diâmetro de tecido pode ser visualizado. Outra opção para resolver este problema foi alterar a duração do segmento de vídeo analisados, para excluir as contracções que afectam grandemente diâmetro luminal, a fim de que as contracções menores são mais facilmente visualizado. Isto conduz ao problema potencial de motilidade que altera minimamente diâmetro luminal olhando semelhante a um stmap separada onde as contracções mudou muito diâmetro luminal. Isto é porque a determinação de pixels brancos no mapa é baseada no diâmetro menor em um determinado vídeo. Se não há muita variação de diâmetro dentro do vídeo (pouca ou nenhuma contracção do músculo circular) muito pequenas contracções que não alteram o diâmetro da preparação grandemente pode ser semelhante ao contracções peristálticas de outro vídeo. Portanto, é importante considerar a figuralegenda no canto superior direito do mapa. Se a diferença entre os diâmetros máximo e mínimo é pequena é importante comparar o stmap para o vídeo que foi gerado a partir de para determinar a validade do pixel mudança sombra como representado na stmap. Assim, o exame da barra de escala em conjunto com a gravação propriamente dita é crítica para corrigir interpretação do mapa.

A gravação de vídeo e de mapeamento de espaço-temporal dos segmentos intestinais do cólon e foram aplicadas a uma variedade de espécies, incluindo peixe-zebra 26, rato 25,27 – 30, de rato 7,9,30 – 33, cobaia 5,6,8,13 – 19, 24,30,32,34,35, trichosurus 12,36, coelho 2,30,37,38, frango 39, porco 40,41 e humano 42. As espécies mais estudados é a cobaia. Isto não é surpreendente porque a cobaia do sistema nervoso entérico hcomo foi mais completamente caracterizado e historicamente tem sido o animal mais estudada in vitro no que se refere à motilidade propulsora do intestino 43. Mapeamento espacial e temporal tem sido aplicada principalmente para os segmentos tubulares de intestino de animais de pequeno porte; no entanto, estudos nos que utilizam sistemas modificados de coelho e porco demonstrar a aplicação desta metodologia para animais maiores. No caso de o coelho, o método é idêntico ao de animais mais pequenos, excepto que segmentos maiores e banhos de órgãos foram usadas 30. A abordagem utilizada no porco era usar um loop exteriorizada de intestino de um porco anestesiado, em vez de imersão de um segmento de tecido dissecado em um banho de órgãos. Além disso, foram geradas por STmaps de correlação cruzada, em vez de o método de transiluminação utilizados na maioria dos estudos 40. O isolado, preparação laço vascularmente perfusão para gravação de vídeo e mapeamento espaço-temporal também tem sido aplicada para as espécies menores, como ratos <sup> 33. Um estudo recente da Kuizenga et al. é o primeiro uso de STmaps de vídeo gravado padrões de motilidade em ex vivo segmentos do intestino humano 42; embora, STmapping abordagens têm sido aplicadas à análise de manométricos (pressão) gravações em seres humanos in vivo 3,44. Os padrões de motilidade gravadas em tecido humano são semelhantes aos já gravada em modelos animais, utilizando técnicas semelhantes e validar a extensão desta abordagem aos tecidos humanos. Vale ressaltar que este estudo STmaps combinados derivados de gravações de vídeo com medição da contração muscular registrada por transdutores de força. Medição da pressão intraluminal de um cateter manométrico fibra óptica inserida no segmento ex vivo também foi convertida em uma stmap, que mostra a versatilidade da stmap para visualizar mais do que alterações no diâmetro luminal. Esta abordagem combinada correlacionando tensão muscular, pressão intraluminal e movimento da parede permitepara uma análise mais aprofundada funcional dos STmaps gerados a partir do registro do vídeo.

Estudos de STmaps gerados a partir de movimentos de parede e alterações no diâmetro luminal (também chamado Dmaps) permitiram descrições detalhadas dos padrões de motilidade, tais como ondas peristálticas de propulsão e contrações segmentares localizadas. Embora estes padrões foram identificados por métodos experimentais anteriores, a abordagem actual permite uma definição mais refinada dos movimentos contráteis localizadas, como ondulações e novas contrações peristálticas anti-9,24,25,30,31,42. A construção de STmaps e análise das mudanças no padrão de motilidade foram aplicados a questões principais na motilidade gastrointestinal do intestino e do cólon. Estes incluem: diferenciação das contrações neurogênicas e miogênica e definir o papel das células intersticiais de Cajal 6,9,11,12,16,24,26,27,29 – 31,33,37 – 40,42, a compreensão do complexointerações entre as camadas musculares circular e longitudinal 2,7,8,11,12,32,39,40, examinando os efeitos de nutrientes intraluminais 10,18,19, 34 estirpes microbianas, e viscosidades 12,36 em vários padrões de motilidade, e compreender o papel dos vários agentes neuro-hormonais endógenos e exógenos agentes farmacológicos 2,4 – 7,9,10,13 – 17,28,35,40 na geração e modificação da motilidade. O futuro desta técnica envolve acoplando-o com outras medidas, incluindo a pressão, eletrofisiologia e tensão / contratilidade. Estudos recentes têm muitas vezes incorporadas uma ou mais destas medições, em conjugação com a gravação de vídeo e de mapeamento de espaço-temporal para fornecer detalhes adicionais correlativos 2,42. Além disso, o sistema pode ser utilizado para medir a motilidade em outros órgãos tubulares e não tubulares. Por exemplo, têm sido feitas tentativas na medição usando a motilidade gástricaum sistema deste tipo, mas a técnica e software precisam de refinamento para quantificar melhor a motilidade em um órgão tão não-tubular 45. Não há dúvida de que a utilização de técnicas de mapeamento de espaço-temporais sozinho e em combinação com métodos mais tradicionais de análise irá conduzir a uma mais profunda compreensão abrangente e de motilidade gastrointestinal no futuro.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DMK foi apoiado por uma bolsa de IRACDA NIGMS (K12GM093857) para Virginia Commonwealth University. Este trabalho foi apoiado por NIDDKD concessão DK34153 para John R. Grider.

Materials

Sodium Chloride (NaCl) Fisher BP358 For Krebs buffer.
Potassium Chloride (KCl) Fisher BP366 For Krebs buffer.
Potassium Phosphate (KH2PO4) Fisher P285 For Krebs buffer.
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma M2643 For Krebs buffer.
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma C7902 For Krebs buffer.
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher BP328 For Krebs buffer.
Glucose Sigma G7021 For Krebs buffer.
Carboxygen (95%O2/5%CO2)
Dissecting pins
Dissecting trays/dishes
Dunkin Hartley Guinea Pigs Charles River Strain 051
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/ Freely available online.
GastroIntestinal Motility Monitor (GIMM) Catamount Inc., St. Albans, Vermont Includes parts listed below.
Peristaltic Pumps Included with GIMM.
Bath Cameras Included with GIMM.
Bath TransIllumination Backlights Included with GIMM.
Organ Baths Included with GIMM.
Backlight Intensity Controls Included with GIMM.
GIMM Processor ImageJ Plugin Included with GIMM.
Polyethylene Tubing Included with GIMM.
Tubing Connectors Included with GIMM.
Masterflex tubing for Peristaltic Pumps Included with GIMM.
Heating Bath/Water Circulator Included with GIMM.
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Kendig, D. M., Hurst, N. R., Grider, J. R. Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines. J. Vis. Exp. (107), e53263, doi:10.3791/53263 (2016).
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