운동성의 시공간 매핑<em> 전의 VIVO</em내장의> 준비

버지니아 커먼 웰스 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)이 프로토콜에서 사용되는 모든 동물과 안락사 절차를 승인했다. 솔루션 1. 준비 크렙스 버퍼의 4 L 준비 ([단위 : mm] 구성 : 118 염화나트륨, 4.75의 KCl을 1.19 KH 2 PO 4, 황산 1.2, 2.54 염화칼슘 (2), (25)의 NaHCO3, 11 포도당). 탈 이온수에 넣고 적당한 양 각 고체 화학 물질의 적절한 양을 칭량하고, 용액이 깨끗해질 때까지 소용돌이를 사용하여 혼합한다. 이어서, carboxygen (95 % O 2, 5 % CO 2)에서 30 분 동안 가열하면서 37 ° C와 용액을 통기. 염산을 사용하여, 필요한 경우 37 ° C (오르간 조에서 동일 온도)에서 pH를 7.4로 조정하면서 용액의 pH를 결정한다. 실험의 길이에 걸쳐 크렙스 버퍼 지속적으로 carboxygenated 37 ℃에서 보관하십시오. 놓다연동 펌프의 버퍼 저장 및 차례에 연동 펌프의 유입과 유출 튜브는 튜브 및 기관 목욕 시스템을 통해 버퍼의 관류를 시작합니다. 참고 : 버퍼 처음 관류 버퍼에 장기 화장실 또는 화학 물질에 어느 조직이 추가 될 때까지 원래의 용기에 다시 펌핑 할 수있다. 이 실험에 필요한 버퍼의 전체 크기를 줄일 수 있습니다. 들어오는 나가는 버퍼가 혼합되지 않도록 다음 나가는 버퍼 관류 라인은 빈 용기에 배치해야합니다. 장기 화장실 내의 버퍼되고 실험이 지속되는 동안 37.0 ± 0.5 ° C를 유지되도록 욕조 순환기에 가열 시스템의 온도를 보정. 확인하고, 필요한 경우, 적어도 하나 이상의 시간 단계 2.8에서 목욕 티슈 세그먼트를 배치하기 전에, 크렙스 완충액의 pH를 변경. 조직의 2. 준비 안락사밀폐 된 챔버 또는 로컬 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 다른 안락사 방법의 이산화탄소 흡입 / 질식 이용하여 기니 돼지입니다. 동물의 안락사를 확인한 후, 해부 가위로 길이 방향으로 복벽을 열고 내장의 위치를​​ 잘라. 맹장을 폭로하기 위해 소장에 첨부 된 장간막을 잘라. 참고 : 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 안락사는 양자 개흉술 등의 보조 절차를 수행 확인합니다. 맹장의 말단부를 찾아 맹장의 연결에 단지 말초 근위 대장을 가로로 쪼개다. 그런 다음 근위 대장에게 첫 절개에 다시 ~ 8cm의 말단을 가로로 쪼개다. 더 해부 용 (섹션 1에서 설명) 예열 및 carboxygenated 크렙스 솔루션으로 결장 조직을 놓습니다. 해부 욕조에 콜론 핀과 가능한 한 많은 장간막 지방을 제거하기 위해 가위의 작은 세트를 사용합니다. 시간에서어갈 해부 트레이, (조직의 천공을 방지하기 위해) 무딘 끝 카테터에 연결된 주사기를 사용 루멘을 통해 크렙스 버퍼의 부드럽게 관류 모든 관내 내용을 제거합니다. 이 재관류 과정에서 세그먼트의 과도한 팽창을 피하십시오. 두 불 연마 유리관 카테터 (3-mm 직경)를 얻어 조직 루멘 진입 유리관의 부분 둘레의 폴리에틸렌 튜브의 짧은 조각 (~ 3mm 길이 ~ 3mm 지름)을 배치했다. 주 :이 봉합사의 보안을 유지하기 위해 조직과 유리 튜브 주위에 배치 및 제조는 기관 및 조직 욕에 길이의 변화가 게재되는 동안 슬립하지 할 수 있도록한다. 조직 준비의 구두 끝으로 한 카테터를 삽입하고 외과 의사의 매듭을 사용하여 카테터를 둘러싼 튜브의 작은 조각 주위에 봉합 넥타이. 조심스럽게 매듭은 꼭 확인하기 위해 다시 밖으로 카테터를 끌어 시도합니다. 그런 다음, 다른 카테터 입력 T에서 동일한 작업을 수행그는 조직의 끝을 반구. 카테터가 확보되면, 장기 화장실 중 하나에 해부 트레이에서 전체 준비 (조직 플러스 카테터)를 이동합니다. 멀리 사용자로부터 직면 구강 끝이 욕조에 준비를 놓습니다. 다음 두 방법 중 하나를 제시함으로써 기관 욕 유리관 카테터 / 마운트 고정. 주 : 튜브 실험 중에 길이를 변경하거나 욕실에서 크렙스 완충액의 액면 위에 오는 조직 세그먼트를 방지 유리를 고정. 옵션 A : 성형기의 클레이 또는 플라스틱 클립을 사용하여 플라스틱 기관 욕의 측면의 상부에 유리관의 상부를 고정. 옵션 B : 플라스틱 클립을 사용하여 장기 목욕 준비 위의 카메라를 보유하고있는 금속 기둥에 유리 튜브를 고정합니다. 카테터가 화장실에 고정되면, 각각의 도관의 개방 단부에 튜브 5 cm 조각을 부착. 구강 고양이heter은 근위 결장 내강의 세그먼트에 버퍼를 주입하기 위해 사용되는 10 mL의 주사기,이 튜브를 부착. 반구 카테터를 들어, 튜브의이 조각은 내강 유출 수집 용기 (50 ㎖ 비커, 저수지 등)에 지시 할 수 있습니다. 경구 단부에 부착 주사기를 사용하여 서서히 플러시 조직을 통해 흐를 수 있도록 액체 조직 루멘을 통해 크렙스 완충액 가온. 유동은 액체가 도관을 빠져 반구에 의해 확인된다. 조직을 30 분 동안 평형을 비디오 녹화 시스템 (프로토콜 부 (3))를 교정. 비디오 레코딩 시스템 3. 교정 밝기, 대비, 소프트웨어를 사용하여 수평 거리 카메라 높이 배치, 비디오 설정을 교정. 참고 : 관내 관류 설정을위한 최적의 설정은 펠릿 추진 (13)의 속도를 결정하는 데 사용되는 설정과 다릅니다. CLI카메라의 실험 탭 (CK)를 보정한다. 그런 다음 '파일'메뉴에서 '보정'을 클릭합니다. 비디오는 '스테이션 교정'창에 표시되면, 이미지는 결장 내강에 삽입 된 카테터의 끝을 포함하는 높이에 카메라를 설정한다. 그리고, 각 조에 부착 투광성 눈금자 스티커를 이용하여 이미지에서 보아 수평 거리를 보정. 참고 :이 교정 내강 직경 및 수축 파의 속도 이후 소프트웨어 계산에 매우 중요하다. 그들은 카메라 이미지의 통치자에 따라 10mm 떨어져 있도록 같은 '보정 워크 스테이션'창에서 붉은 수직 가이드 라인을 설정합니다. 그런 다음, '거리 커서'창에 적절한 거리 (10mm)를 입력하고 'CAL'버튼을 클릭합니다. 다음에, 이득, 밝기를 조정하고 있기 때문에 카메라 영상을 수정하는 '워크 스테이션을 보정'윈도우 내에 슬라이더 셔터조직 세그먼트는 밝은 배경에 어두운 실루엣으로 나타납니다. 참고 : 그림 4는이 교정 절차의 좋고 나쁜 예를 보여줍니다. 제대로 이미지를 조정하려면, 또한 카메라 자체에 초점과 조리개 노브를 조정합니다. 교정이 완료되었습니다. 다음 '종료'버튼을 클릭 마지막으로 팝업에서 '확인'을 클릭하고, '저장'을 클릭합니다. 4. 일반 실험 절차 카메라 보정 절차 및 조직 평형의 30 분을 완료 한 후 각 실험 프로토콜의 시련 이름을 지정합니다. 시험 이름 및 이름 화합물 및 액체의 체적 농도에 기초 할 수는 intraluminally 실험의 부분 동안에 티슈 세그먼트로 관류된다. 그리고, 호스 클램프의 사용을 통해 반구 카테터로부터 돌출 관을 폐색. 참고 :이 푸 동안 반구 끝을 종료에서 내강 액을 방지rther 실험, 다양한 레벨의 팽창을 야기하는 루멘 특정 볼륨의 사용을 허용한다 (그림 1). 기니피그 생체 준비 추진력 수축을 개시하기에 충분한 팽창을 제공하는 근위 결장 내강에서 약 0.7 ml의 크렙스 완충액을 주입한다. 주 :이 볼륨이 다소 다를 수 (0.1-0.2 ml)에 그대로 세그먼트의 전체 길이와 기관 욕에서 세그먼트에인가 스트레치의 양에 따라. 세그먼트가 내강 유체에 의해 팽창시킨다되면, 카메라 전원을 켜고 다음 시간의 미리 정해진 기간 (예, 10 분)에 대한 운동성을 기록합니다. 특히, 실험 카메라보기를 연 다음 카메라 필드를 볼 수있는 "ON"위치로 토글 스위치를 클릭하여 적절하게 명명 된 시험을 두 번 클릭합니다. (카메라가 촬영하는 동안 녹화 버튼이 빨간색으로 유지됩니다) 다음에, 기록 시작하려면 녹음 단추를 클릭하십시오차 녹음을 중지 다시 녹화 버튼을 클릭합니다. 이 초기 제어 팽창 시험의 끝에, 조직 세그먼트는 루멘에서 distending 액체 추진 수 있도록 반구 카테터를 흡장 클램프를 제거 / 푸. 10 분 재 – 평형 기간 후에, 세그먼트 (예를 들면, 단쇄 지방산 또는 데칸의 추진 운동을 수정 내강 유체 영양소, 생물 활성제, 의약품, 또는 효능 제 / 길항제는 임의의 다양한이 절차를 반복 산) 10,18. 기포의 진행 루멘 결장 내로 새로운 솔루션의 재관류시에 사용자가 언제 실험 유체를 알 수 있도록 새로운 실험 유체 결장 세그먼트 들어가면 게이지를 돕기 위해, 주사기의 포트 근처에 기포를 남겨 루멘에 도달했습니다. 거품을 완전히 밀어 때까지 열린 반구 카테터 관내 관류 계속내강 관류 시스템 (관류의 2-3 ml를가 필요할 수 있음). 이어서, 조직 세그먼트는 최대 5 분 동안 열기 반구 카테터를 통해 유체를 배출 할 수있다. 참고 :이 절차 후, 루멘은 루멘으로 액체의 알려진 볼륨의 관류를 허용, 유체의 무시할 볼륨을 포함 할 것이다. 다시 흡장 튜브 클램프를 이용한 반구 내강 카테터 튜브 (단계 4.3에서와 같이하면) 주사기를 통해 제어 조건과 유체 distending 동일한 볼륨을 주입. (단계 4.5에서와 같이) 제어 크렙스 상태로 나중에 분석 및 비교를위한 실험 기간 동안 운동 패턴을 기록합니다. 반복 부 4.4 – 내강 다른 화합물 또는 화합물 같은 내강 상이한 농도와 프로토콜 4.7. 시공간지도 5. 건설 (STmaps) 실험을 기록 완료 후, 분석 바람을 열 특정 재판의 이름을 두 번 클릭흐름 STMAP의 건설. 비디오 재생 영역 내에서 분석을 위해 이미지를 적절하게 분석 창에서 명암과 밝기 슬라이더를 조정 (밝은 배경에 검은 조직 실루엣, 그림 4). 주 : 카메라 보정 이미지는이 시점에서 작은 범위로 수정할 수있는 실험을 시작하기 전에 적절하게 수행되지 않은 경우. 이미지가 올바르게 대조하면, 분석을 위해 조직 영역을 분리하고 생성물을 함유하는 영역을 제거하기 위해 비디오 영상 윈도우 내의 수평 및 수직 적색 지침을 설정한다. 또한, 시작을 결정함으로써 기록에서 적절한 시간 세그먼트를 선택하고 분석 시점을 멈춘다. 구체적으로는, 해석 소프트웨어 내에 녹색 'A'및 노란색 'B'버튼을 사용하여 비디오 내의 시작 및 종료 지점을 선택한다. 분석하는 영상 구간의 시작과 상기 시간 슬라이더를 설정할N 녹색 'A'버튼을 클릭합니다. 그런 다음, 분석하고 노란색 'B'버튼을 클릭 세그먼트의 끝에 슬라이더를 설정합니다. 다음으로, STMAP 창을 열고 '스톱워치'버튼을 클릭 할 수있는 '모터 분석'탭을 클릭합니다. 스톱워치를 클릭 한 후, 다음 STMAP 생성을 시작하는 기록 영화 내에서 조직의 검은 실루엣 내 십자선 커서를 클릭합니다. 조직 실루엣에 십자선을 클릭 한 후, 소프트웨어를 생성 및 비디오의 그 지역의 STMAP를 표시합니다. 참고 :이 분석을 위해 선택한 비디오의 길이에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 이미지를 조절 STMAP 및 컨트롤의 확대 된 이미지를 볼 수 '줌'을 클릭합니다. 컬러 대신 흑백으로 STMAP를 보려면 새로 만든 창에 '컬러'옵션을 클릭합니다. 또한,지도 및 V 내의 특정 픽셀에 커서를 배치 할 수 있도록 '사용'옵션을 클릭합니다특정 조직 영역에 대해 내강 직경의 변화를 추적 서평. 끝나면 '종료'를 클릭하십시오. 논문 또는 프레젠테이션에 사용하기 위해 STMAP를 내보내거나 다음 '메타 파일' '데이터 내보내기'를 선택하고 다음에 '파일'메뉴를 선택하여 ImageJ에 더욱 분석. 그런 다음 .EMF 파일로 저장됩니다 STMAP를, 이름을 지정하고 '저장'버튼을 클릭합니다. 또는, 스크린 샷을 캡처하여 STMAP의 이미지를 저장합니다. 이 STMAP의 의사 색 버전을 저장할 필요가있다. STmaps의 수축 파 속도 6. 분석 수축 전파 또는 수축의 지속 시간의 속도를 분석하려면 먼저 티파니, .gif 참고, .JPG, 또는 선택의 파일 변환 프로그램을 통해 ImageJ에하는 것이 허용 .BMP 형식으로 STMAP .EMF 파일을 변환합니다. 참고 : ImageJ에 소프트웨어에서 STmaps의 .EMF 형식으로 출력을 열지 않습니다. Alternativ엘리 사용 스크린 캡처 소프트웨어가 화면 STMAP의 사진을 촬영하고 해당되는 파일 형식으로 저장. 그런 ImageJ에의 재 포맷 STMAP를 열고 "플러그인 '메뉴를 선택하고'열기 GIMMProcessor을하여 GIMMProcessor ​​플러그인을 열고 GIMMProcessor ​​'과'측정 표 '창'.이 모두가 열립니다 '. 클릭하고 STMAP의 오른쪽 위 모서리에있는 scalebar의 전체 영역을 드래그하여 윤곽선을 사용하고 ImageJ에 창 내에서 '사각형 선택 도구'를 클릭합니다. 해당 지역을 선택하면, 플러그인의 '설정 조정'버튼을 클릭합니다. 마지막 scalebar에 값에 따라 교정 창에 적절한 거리 (mm)와 시간 (초)을 삽입하고 '완료'를 클릭. 다음으로, ImageJ에 창에서 선 그리기 도구를 클릭합니다. 번째의 각도를 따라 전파 수축 중심을 STMAP에 선 그리기클릭하고 STMAP 이미지를 드래그하여 전자 슬로프입니다. 또는, 수축의 지속 시간을 결정하기 위해 비 전파 수축의 밴드를 통해 수직 선을 그립니다. 라인이 적절하게 인출되면 (단지 하나의 라인이 한 번에 그려 질 수있다), 라인의 수평 거리, 수직 거리 및 기울기의 판독을 생성하는 플러그인에 '측정을'버튼을 클릭; 각각 길이 (mm), 시간 (초) 및 속도 (㎜ / 초)에 해당한다. 이 데이터는 '측정 표'창에 표시됩니다. 선 그리기를 반복하고 분석은 주어진 STMAP 내에서 여러 번 단계와 .gmd 파일로 데이터를 저장합니다. 플러그인에서 '저장'버튼을 클릭하고 파일 이름을 지정합니다. 그런 다음 프로세스를 완료하기 위해 다시 '저장'을 클릭합니다. 이러한 데이터는 나중에 다른 시험 데이터와 비교 또는 STMAP에 선 그리기 다시 사용될 수있다.