小鼠胚胎干细胞的聚集体的产生，显示对称破缺，极化和突发集体行为<em>体外</em

1.培养条件之前，聚合保持在ESLIF介质mESCs（见表具体材料和设备的配制）在加湿培养箱明胶涂层为 25cm 2的组织培养处理的烧瓶在37℃和5％CO 2 21-25共 。 生长的细胞至少有两个通道，在这个协议中，使用前解冻后;细胞在较低的通道是一般更成功在整个实验重复产生可再现的特性（即，不超过15个传代培养），不同的ES细胞系之间然而细微变化是可以预期的（见表2所测试的细胞系）。 培养细胞40-60％汇合。不要使用过度融合细胞的聚集。 2.生成集料预温PBS（+ 钙 ，镁+ 2 +），ESLIF，N2B27 26,27 </sup>和胰蛋白酶-EDTA在37℃水浴中。 从组织培养瓶中吸出培养基（步骤1.3）。用5毫升的PBS轻轻漂洗烧瓶，两次。吸出PBS并加入预热的胰蛋白酶-EDTA（0.25％）的1〜2毫升以解离细胞。 放置在孵化器的烧瓶<5分钟或直到细胞已经从烧瓶的表面完全脱离。移液器上下用1毫升吸管，以产生单细胞悬浮液计数准确和均匀的聚集体尺寸的形成。 胰蛋白酶中和5-10毫升ESLIF;洗下生长表面最大化细胞回收并转移到50毫升离心管中。除去1毫升等分试样从离心管中并计数细胞用血球计。 确定悬浮液，得到10个细胞/微升所需的体积（整体的96孔板需要5×10 4个细胞在5ml的悬浮液）。细胞计数准确，大频偏从规定的细胞数目离子可以聚集体对刺激的反应产生不利影响。 添加5×10 4个细胞到5ml预热的PBS在新鲜的50ml离心管中，并在旋转〜170×g离心5分钟。 小心吸PBS的加入5 ml预温PBS轻轻的;不干扰沉淀在试管的底部。离心在〜170×g离心5分钟。 小心吸PBS第二次。除去尽可能多PBS作为可能的，而不干扰颗粒为PBS携带可聚合产生不利影响。用P1000吸管，以产生均匀的细胞悬浮液，接着再加入N2B27至所需体积首先重悬沉淀在1ml温暖N2B27（为一个5×10 例如添加 4 ml的4个细胞/ 5ml混悬液）。 细胞悬液转移到无菌的贮存器和吸管40微升液滴进入非组织培养处理过的各孔的底部，'U'底96瓦特使用多道移液器ELL板。覆盖96孔板，其相应的盖和确认细胞与一个倒置的台式显微镜（图1B）的存在。 注意：重​​要的是，这些板用于限制细胞粘附的可能性。别涂布96孔板用明胶，纤连蛋白或促进细胞粘着的任何其他涂层的底部。 孵育细胞48小时，在湿润的培养箱中在37℃和5％CO 2的聚合。 3.应用刺激与改变中以下的48小时温育期，观察mESCs的外观的96孔平板的每个孔中，以确认成功地聚集（图1E）。注意：聚集会出现球形性质，在直径约为150-200微米。请参阅故障排除部分，如果出现问题（ 表1）。 0;添加150微升新鲜的辅助介质（3μMChi99021（中）在N2B27 19;股票在DMSO准备在10毫米）使用多道移液器每孔。吸移管以足够的力量，以清除可能已经开始粘附于孔的底部的任何聚集体。在37℃和5％的CO 2（图1A），在湿润的培养箱中孵育聚集在次级介质24小时。 注意：使用这种辅助介质中生成可重复的拉长和偏振聚集。其他次级介质组合物也可以根据需要和实施例显示在图3中的实验条件下使用。 对于随后的介质的变化，使用以一定的角度（大约30°）保持多道移液器从每个侧面轻轻取出150微升次级介质的井。然后，吸管150微升新鲜N2B27到每口井有足够的力量，以清除可能有任何开始聚集版附着在孔的底部。 重复点3 3，每24小时，直到时间过程是完整的（聚合培养实验的典型长度为120小时）。 注意：确保聚集体自由移动以下介质的变化，以确保内，每个96孔板之间的再现性和一致性。平台必须每天改变以下聚合期间。 4.准备骨料的免疫染色分析激光共聚焦显微镜固定和初级抗体孵育注意：由AK Hadjantonakis 28所描述的协议已被修改，以适应卓制粒料免疫染色。在我们的研究和它们的稀释液所用的典型的抗体，参见先前发表的作品19,21,24,25,29和表3中。 使用以一定的角度举办了多道移液器（约30℃），轻轻从侧面Ø去除150微升媒体f各自孔的96孔板的。吹打150微升PBS到每口井洗两​​次。留下几个每次洗涤之间的分钟，以使聚集体沉降。 设置P1000的吸移管以分配200微升，附上对应的枪头和切断约3毫米，从与一对无菌剪刀的尖端的末端。在96孔板的每个孔中绘制的PBS的一部分的短的方式进入尖端排出它以搅拌聚合。 使用相同的尖端井内包括骨料和吸管放入小（直径30毫米）玻璃果蝇夹层以及绘制出整个卷。传送从96孔板，将经历相同的免疫染色体制成相同的玻璃夹层以及所有的聚集体。 注：从不同的实验条件转移聚集的时候，以防止聚集结转使用新大切的枪头。 放置包含骨料玻璃井ES到解剖镜下。摇动玻璃以及迫使聚集体的中心，并吸出PBS从井一面用玻璃巴斯德吸管。使用显微镜，以确保聚集体不吸出。留出一个小体积的PBS中的玻璃以及以覆盖聚集体，以防止它们干燥。 加入1毫升新鲜制备的甲醛（4％）溶解在PBS中孵育2小时，在4℃在定轨摇床设定为低速。注意：多聚甲醛是已知的过敏，致癌和毒性。穿戴合适的保护，同时处理。 下列固定，吸中相同的方式的甲醛溶液如第4 1 4中所述，用1毫升的PBS三次，每次洗涤洗聚集体，用10分钟，在定轨摇床设定为低速。 吸出PBS作为第4. 1. 4描述的和用含10％胎牛血清和0.2％三执行另外三个，10分钟洗涤吨X-100（PBSFT）。上执行轨道摇床设定为低速的10分钟洗涤。 注意：在一个明确的洗涤缓冲液使用胎牛血清（FBS）的结果，减少了协议期间如果使用牛奶，否则将失去的聚集体的数目。要注意的是以下固定术，免疫组织化学程序，可以在除下面详述的其他各种方式执行，并且应当确定和由研究者优化是重要的。 方框在轨道摇杆设定为低速，在4℃在PBSFT聚集体1小时。该协议可以在此时被暂停，并聚集阻止O / N，并持续搅拌在水平回转摇杆在4℃。 吸出PBSFT如先前所述（见节4. 1. 4）和孵化用500μl稀释在PBSFT O / N所需初级抗体的聚集体在4℃下于轨道摇床设定为低速。用石蜡膜覆盖，以防止蒸发。 二级抗体孵育吸出第一抗体溶液并用1ml PBSFT以下述方式清洗（4℃）：5分钟两次;三次15分钟;和四到七倍1小时。执行在4℃和在定轨摇设置为低速每个洗涤步骤。注：冰寒洗使用中之前。不要在冰上进行清洗，因为这可能会导致聚集到片段。 吸出最后一次洗涤介质和孵育在500μlPBSFT O / N所需的二级抗体的聚集体，在4℃在黑暗中在水平回转摇杆。加入核染色，如赫斯特（如果需要）。 共聚焦显微术安装和成像如第4节1.4描述了4℃PBSFT洗涤聚集体。最后一次洗涤后，冲洗骨料与含有1ml的PBS 0.2％FBS和Triton X-100（PBT）以下列方式：5分钟两次;三次15分钟。执行洗涤在RT在定轨摇避光。 吸出介质如先前所述（部分4 1 4）和温育30分钟，在黑暗中以1：1的溶液甘油：PBT（1毫升），接着由第二孵育30分钟以7：3的溶液甘油：PBT（1毫升）中。 注意：在使用旋转器混匀甘油和PBT溶液在4℃下。 吸出最后的甘油：PBT解决方案，并添加1 ml封固剂24。该协议可以在此时安装前被暂停（如果暂停，密封该孔用石蜡膜并存储染色孔，在4℃）。 吹打它们在17微升液滴的切口P20前端（图2）安装在显微镜载片上的聚集体。折叠双面胶带回到它自身上四次，以产生隔板和附加到幻灯片的各端。放置顶部盖玻片（22毫米×60毫米）在这些隔离物（ 图2）。 注：这是必不可少的切尖在此阶段使用，以便不损坏样品。隔板防止盖玻片压碎骨料。 一旦聚集安装，使用图像使用协议共聚焦显微镜的样品前文所述19,21,24,25。一旦放置在显微镜下，离开不受干扰舞台上的滑动几分钟以使聚集到安装平台内沉降。