Måling Satser for Ukrudtsmiddel Metabolisme i tokimbladede Ukrudt med en udskåret Leaf Assay

Herbicidresistens i ukrudt udgør en alvorlig trussel mod den globale produktion af fødevarer og fibre ^1,2. I øjeblikket tusindvis af resistente populationer og biotyper fra over hundrede ukrudtsarter verdensplan er blevet dokumenteret og studeret ^3. En væsentlig mekanisme, der giver herbicidresistens i planter er ændringen af herbicid target-site gener og proteiner, herunder genetiske mutationer, der påvirker herbicid-proteinbindende kinetik eller amplifikation af target-site-gen ^2. Metabolisk afgiftning via forhøjede aktiviteter af cytochrom P450 monooxygenase (P450) eller glutathion S transferase (GST) enzymer er en anden mekanisme, som giver herbicidresistens i ukrudt, som er forskellig på flere måder fra target-site-mekanismer ^2. Metabolisk-baserede modstand har betydelige konsekvenser for, om planter fitness omkostninger (aka fitness sanktioner) kan resultere fra herbicid-resistens mechanism, samt om potentialet for en enkelt afgiftning mekanisme til at bibringe tvær- eller flere herbicidresistens i ukrudt populationer ^1,2,4. Generelt kan herbicid metabolisme i planter opdeles i tre særskilte faser ^5. Fase I involverer herbicid konvertering eller aktivering, såsom P450-medieret hydroxylering af aromatiske ringe eller alkylgrupper, eller ved N – eller O- dealkyleringsprodukter reaktioner, der fører til øget polaritet og delvis herbicid afgiftning ^5,6. Nyligt indførte funktionelle grupper i fase I kan give sammenkædning websteder for konjugering til reduceret glutathion ved GST'er eller glucose ved UDP-afhængige glycosyltransferaser i fase II ^5,7. For eksempel, de store oprindelige metabolit primisulfuronmethyl i majs er hydroxy-primisulfuronmethyl ^8, som yderligere kan metaboliseres til hydroxy-primisulfuron-glucosid (fase II) og derefter transporteres til vacuolen til opbevaring langvarig eller yderligere metabolisk probejdning ^5,6 (fase III).

Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) er en vanskelige at kontrol, tokimbladede årlige ukrudtsarter, der hindrer produktionen af majs (Zea mays), sojabønne (Glycine max), og bomuld (Gossypium hirsutum) i USA. Den høje grad af genetisk diversitet waterhemp lettes ved sin tvebo biologi og langdistance-vind bestøvning, og en enkelt kvindelig waterhemp plante kan producere op til en million frø ^9. Disse frø er små og let spredes, hvilket naturligvis udstyre waterhemp med en effektiv spredningsmekanisme. Waterhemp viser løbende spiring hele vækstsæsonen ^9, og dens frø er i stand til at spire efter flere års dvale. Waterhemp er en _C4 plante, der har en højere vækstrate end de fleste bredbladet ukrudt i dyrkede dyrkningssystemer ^10. Desuden har mange waterhemp populationer er resistente over for multiple families af herbicider ^3.

En population af waterhemp (betegnet MCR) fra Illinois er resistent over for 4-hydroxy-phenylpyruvate dioxygenase (HPPD) hæmmende herbicider ^{11, såsom} mesotrion, samt atrazin og acetolactatsyntase (ALS) hæmmende herbicider, herunder primisulfuronmethyl på grund af ikke-mål-site mekanismer ^12,13. En anden population af waterhemp betegnet ACR ^14, som er primisulfuronmethyl-resistente (som følge af en mutation i ALS-genet) og atrazin-resistente, men følsomt over for mesotrion, og en waterhemp population udpeget WCS ^{14, der} er følsom over for primisulfuronmethyl, mesotrion, og atrazin blev anvendt i sammenligning med MCR i vores tidligere forskning ¹² og aktuelle forsøg (opsummeret i tabel 1). Indledende undersøgelser ikke påvise ændringer i HPPD gen sekvens eller ekspressionsniveauerne eller reduceret mesotrion optagelse i MCRbefolkning sammenlignet med mesotrion følsomme befolkningsgrupper ^12. Men metabolisme med hele planter viste signifikant lavere niveauer af forældre mesotrion herbicid i MCR i forhold til ACR og WCS, som korreleret med tidligere fænotypiske svar til mesotrion ^11,12.

* Ikke-target-site resistensmekanismer, bortset forbedret stofskifte, kan også bibringe mesotrion modstand i MCR befolkning ^12.

Tabel 1: Beskrivelse af waterhemp populationer fra Illinois anvendt i denne undersøgelse.

Ud over at bestemme satserne for herbicid metabolisme i intakte waterhemp kimplanter, blev en anden eksperimenterende tilgang udviklet og anvendt i vores tidligere forskning for at undersøge metabolisme ved hjælp af en udskåret waterhemp blad assay ¹² samt forskellige P450-hæmmere (f.eks tetcyclacis og malathion). Denne fremgangsmåde blev tilpasset specielt til waterhemp fra en tidli-skellige undersøgelse af primisulfuronmethyl metabolisme i udskåret majs blade ^{15, da} det udskårne blade assay endnu ikke var blevet rapporteret for udførelse herbicid metabolisme forskning i en tokimbladet plante. Den organophophosate insekticid malathion er ofte blevet brugt til in vivo og in vitro herbicid-metabolisme forskning for at angive P450 engagement ^16. For eksempel, tolerance og hurtig metabolisme af mesotrion i majs skyldes P450-katalyseret ring hydroxylering, som blev kontrolleret, når malathion øget følsomhed over for majs mesotrion ^17. Tilsvarende malathion hæmmede metabolisme af ALS-hæmmer primisulfuron-methyl i udtaget majs blade ^15. En stor fordel ved den udskårne blade teknik er, at data, der genereres er uafhængige af hel-plante translokation mønstre, at en vigtig faktor at overveje ved vurderingen metabolisme af systemiske, postemergente herbicider i planter. Derfor er denne metode tillader kvantitativ ogkvalitative metaboliske analyser til at fokusere på en enkelt behandlet blad ^12.

En vegetativ kloning strategi, i kombination med det udskårne blade protokollen, er tidligere anvendt i waterhemp at gennemføre metabolismeundersøgelser ^12. På grund krydsningspotentiale natur waterhemp (separat mandlige og kvindelige planter), og høj grad af den genetiske mangfoldighed inden for tvebo Amaranthus arter ^9, denne protokol sikres, at genetisk identiske waterhemp kimplanter blev analyseret inden for tidsforløbet eksperimenter. Denne artikel viser nytten af ​​det udskårne blade metode til måling satser herbicid metabolisme i en tokimbladet ukrudt (waterhemp). Mængden af forælder herbicid resterende blev bestemt ved hvert tidspunkt (figur 1) ved ikke-lineær mindste kvadraters regressionsanalyse, og er udstyret med et simpelt første ordens kurve med henblik på at estimere tiden for 50% af det absorberede herbicid til at nedbryde ( DT _50). Repræsentantkromatogrammer fra omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) vises for ALS-resistente og -følsom waterhemp populationer, der angiver forsvinden forælder herbicid og samtidig dannelse af polære metabolit (ter) i en tidsforløbet undersøgelse (figur 2). Fokus i vores artikel er at beskrive og demonstrere anvendeligheden af det udskårne blade analysen i kombination med en vegetativ kloning metode til bestemmelse præcise og reproducerbare satser for herbicid metabolisme i tokimbladede planter, ved hjælp af ensartet ring-mærket (URL- ^14C) herbicider i tre waterhemp befolkninger, der adskiller sig i deres hel-plante reaktioner på HPPD- og ALS-hæmmende herbicider (tabel 1).