Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules T périphériques humains à l'aide de virus Sendai dans des conditions libres Feeder-

1. Préparer les lymphocytes T activés humain Recueillir 10 ml héparinés sang total d'un donneur par ponction veineuse. Obtenir le consentement éclairé des donneurs à l'avance de la ponction veineuse. Ponction veineuse doit être effectué par du personnel qualifié et formé. Manipulez les échantillons sanguins obtenus avec du matériel stérile et des lignes directrices en matière de biosécurité appropriées suivantes. Diluer 10 ml de sang entier héparinisé avec 10 ml D-PBS (-). Mettre 15 ml de solution de Ficoll (PREMIUM Ficoll-Paque) dans un nouveau tube conique de 50 ml. Couche de la solution de sang de 20 ml préparée à l'étape 1.2 sur la solution de Ficoll à l'étape 1.3. En utilisant une pipette électrique, laissez solution de sang préparé à l'étape 1.2 courir lentement le long de la paroi intérieure du tube. Veillez à ne pas mélanger la solution de sang et de solution de Ficoll. Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante. Réglez la vitesse de décélération centrifuge pour "ralentir". Remarque: Après centrifugation, une fine blanchecouche émerge entre une couche de plasma laiteuse supérieure et une couche de Ficoll inférieure claire. Cette mince couche blanche contient des cellules mononucléaires. Transférer la couche de cellules mononucléées dans un nouveau tube conique de 50 ml avec une pipette de 1 ml. Soyez prudent de ne pas inclure solution de Ficoll. Ajouter D-PBS (-) pour les cellules mononucléaires à un volume total de 10 ml, et centrifuger à 200 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant. Ajouter 10 ml de D-PBS (-) pour les cellules mononucléaires, et centrifuger à 200 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant, ajouter 1 ml de milieu KBM502 aux cellules mononucléaires recueillies, et de compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Plus de 5 x 10 6 cellules mononucléaires peuvent être obtenus à partir de 10 ml du sang total hépariné avec une séparation appropriée à l'aide de Ficoll. Préparer une solution anti-CD3 humain anticorps à une concentration de 10 pg / ml dans du D-PBS (-). Ajouter la solution d'anticorps anti-CD3 humain à une plaque de 6 puits, faire tremper les vaguesas de chaque puits et incuber le plat à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 de 5% pendant au moins 30 min. Retirer la solution d'anticorps anti-CD3 humain à partir de chaque puits et laver une fois avec du D-PBS (-) juste avant l'ensemencement des cellules. Des cellules mononucléaires de semences qui ont été préparés à l'étape 1.9, à une densité de 2,5 x 10 5 cellules / cm 2 sur les CD3 anti-humain de l'anticorps enduit des plaques à 6 puits dans du milieu KBM502. Incuber à 37 ° C dans un 5 incubateur -CO 2% pendant 3-7 jours sans changement de milieu jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence T. Cellules T dans cette période sont les deux cellules en suspension et adhérents. 2. Infect T cellules humaines avec SeV Vecteurs Après la culture 3-7 jours, recueillir les cellules T activées avec un milieu existant par pipetage. Les transférer à un tube conique de 15 ml et centrifuger à 200 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le surnageant et ajouter 1 ml de milieu de KBM502 frais. Compter les cellules et la plaque 1.5 x 10 6 cellules (dans 2 ml de milieu frais KBM502) dans chaque puits d'une plaque à 6 puits revêtues d'anticorps anti-CD3. Décongeler les solutions SeV de OCT3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, et c-MYC (HNL) -sev / TS15ΔF sur la glace. Ajouter les solutions contenant OCT3 SeV / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF, et c-MYC (HNL) -sev / TS15ΔF individuellement dans les puits, chacun à une multiplicité d'infection (MOI) 10. Incuber à 37 ° C dans un 5 incubateur -CO 2% pour 24 une autre heure. 3. Retirez Vecteurs SEV de la T cellules humaines 24 h après l'infection, les cellules infectées recueillir avec une pipette. Si il ya des cellules adhérentes, elles se détachent facilement les pipetage à plusieurs reprises de haut en bas. Les transférer à un tube conique de 15 ml, et centrifuger à 200 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le surnageant contenant les vecteurs SEV, et ajouter 2 ml de milieu de KBM502 frais. Cellules replate dans each des puits. Incuber à 37 ° C dans un 5 incubateur -CO 2% pour une heure 24 supplémentaire. 4. Les cellules réensemencer sur une couche de Matrigel Préparer la solution de la matrice de la membrane basale par le gel de la matrice de la décongélation (s'il vous plaît voir la liste des matériaux pour la marque spécifique utilisée dans cette étude) au 4 ° C et la dissolution de 0,2 ml dans 10 ml de milieu DMEM / F12. Remarque: gel de Matrix (voir s'il vous plaît la Liste des matériaux pour la marque spécifique utilisée dans cette étude) besoin de dégeler O / N à 4 ° C pour être complètement dégelé. Gardez-le sur la glace jusqu'à ce que juste avant l'utilisation. Planche 5 ml de solution de matrice de la membrane basale dans des plats par boîte de 100 mm et de laisser à température ambiante pendant au moins 30 min avant l'ensemencement des cellules. Au moins deux plats de 100 mm sont nécessaires pour une expérience. Recueillir des cellules SeV-infectés par le pipetage, les transférer dans un tube conique de 15 ml, et centrifuger à 200 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le surnageant et ajouter 1 ml de milieu de KBM502 frais. Comptez le nombre de CElls en utilisant un hémocytomètre, retirez la solution sous-sol de la matrice de la membrane des plats de 100 mm préparé à l'étape 4.2 et la plaque 1 × 10 5 et 1 × 10 6 cellules (dans 10 ml de milieu de mTeSR frais) sur un 100-mm membrane basale matrice revêtu de la vaisselle. Enfin, utilisez la plaque dans laquelle les colonies sont facilement ramassés. Incuber le plat à 37 ° C dans un 5 incubateur% -CO 2 H / N. Changer le support à 10 ml chair moyen mTeSR chaque autre jour. Remarque: Environ 20-30 jours après l'infection, les colonies qui ressemblent étroitement à des cellules souches embryonnaires (CSE) apparaîtra. 5. Développer T CSPi cellulaires dérivées Préparer la solution de la matrice de la membrane basale par le gel de la matrice de la décongélation (s'il vous plaît voir la liste des matériaux pour la marque spécifique utilisée dans cette étude) au 4 ° C et la dissolution de 0,2 ml dans 10 ml de milieu DMEM / F12. Planche 1 ml de la solution de matrice de membrane basale par puits dans une plaque à 6 puits et laisser à température ambiante pendant aumoins 30 min avant prélèvement de colonies. Remplir une plaque de 96 puits avec 20 pi de milieu mTeSR par puits. Sélectionnez colonies qui ressemblent CES sous le stéréomicroscope aide d'une pipette de 20 pi. Remarque: Les colonies de CES et CSPi sont rond et plat comme dans la figure 1B. Transfert colonies sélectionnées dans la plaque de 96 puits rempli avec un milieu mTeSR à l'étape 5.3. Ajouter 200 pi de milieu mTeSR à chaque puits et soigneusement la pipette de haut en bas pour briser la colonie en petites touffes sous le stéréomicroscope aide d'une pipette de 200 pi. Retirer la solution de la matrice de la membrane basale du bien préparé en 5.2 et de mettre chaque colonie dans un puits de la matrice revêtu membrane basale plaque de 6 puits avec 2 ml de milieu mTeSR par puits. Changer le support à 2 ml chair moyen mTeSR tous les autres jours. 6. Maintenir T CSPi cellulaires dérivées Les iPSCs dérivés de cellules T peuvent être maintenuset stockée en utilisant les mêmes techniques que pour les CSPi humaines et CES de l'homme. Une fois colonies iPSC grandissent, développez-les dans de grands plats en répétant la même procédure. Changer le support mTeSR tous les 1-2 jours. Lorsque les colonies deviennent confluentes tous les 5-7 jours, passage des cellules en utilisant une solution de dissociation pour les CSPi humaines et CES de l'homme conformément aux instructions du fabricant.