The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
Den viktigste fysiologiske rollen til skjelettmuskulatur mitokondrier er å frembringe ATP fra es oksidativ fosforylering. Viktigere, muskelavslappende mitokondriene spiller en spesiell rolle i treningskapasitet 2, aldring 3, degenerative sykdommer 4 og type II diabetes 5. Som et aldrende samfunn, og Type II Diabetes er den 7. største dødsårsaken i USA seks, har behovet for metoder som vurderer mitokondrienes funksjon blitt stadig mer utbredt i biomedisinsk forskning 7,8. Nærmere bestemt har måling av oksygenforbruket eksepsjonell nytte i vurderingen av mitokondriell funksjon siden den representerer koordinerte funksjonen mellom mitokondrielle og nukleære genom til å uttrykke funksjonelle komponenter av oksidativ fosforylering 9.
Flere teknologier eksisterer som muliggjør måling av oksygenforbruket i intakte celler og isolered mitokondrier 7-10. I tillegg har tester blitt utviklet for flere celletyper og vev, og i en rekke arter som gir mulighet for måling av mitokondrielle trasé og luftkontroll 9,11,12. Men det er i dag et tomrom i litteraturen i forhold til utarbeidelse av alle disse analysene bruker isolerte mitokondrier fra mus skjelettmuskulatur for bruk i mikro basert oksygenforbruk teknologier. Viktigere er bruk av mikro basert respirometrisk analyser vokser blant mitokondrielle biologer og gir mulighet for høy gjennomstrømning målinger ved hjelp av minimale mengder av isolerte mitokondrier 9. Derfor ble en samling av mikro basert respirometrisk analyser utviklet som gjør det mulig å påpeke hvor abnormaliteter og / eller modifiseringer som kan ha oppstått i elektrontransportkjeden (ETC). I tillegg ble to ekstra mikro basert respirometrisk analyser utviklet som gjør det mulig å vurdere samordning between trikaboksylsyre (TCA) syklus og ETC, og mellom ß-oksidasjon og ETC. Viktigere, de presenterte metodene gir en klar og konsis måte å måle mekanistiske endringer i mitokondrienes funksjon i en vanlig dyremodell.
Metodene som presenteres i denne artikkelen gir trinnvise instruksjoner for ytelsen til en samling av mikro basert respirometrisk analyser ved hjelp av mitokondrier isolert 75-100 mg mus skjelettmuskulatur. Disse analysene kan utføres med høy presisjon som gjenspeiles av den stramme standardavvik mellom triplikatbrønner. Viktigere, disse respirometrisk analyser tillater pinpointing av hvor abnormaliteter og / eller tilpasninger som kan ha oppstått i ETC, TCA syklus, β-oksidasjon vei, underlaget transportører, etc. i en vanlig dyremodell.
Det er viktig å synliggjøre begrunnelsen for bruk av ulike typer brensel og hemmere brukes i denne protokollen. Den pyruvat / malat og glutamat / malat respirometrisk analyse tillater vurdering av komplekset I mediert åndedrett, så vel som vurdering av de respektive transportører, og i tilfelle av glutamat, den 15 deaminase. Alternativt kan en kombinasjon avsuccinate / rotenon gjør vurderingen av mitokondrieåndedretts fluks gjennom Complex II av ETC siden rotenon hemmer kompleks jeg og succinate gir elektroner til Complex II via reduksjon av flavin adenindinukleotid (FADH 2) 15. Disse analyser tilveie substrat spesifikk informasjon med hensyn til koblingsgrad og maksimal respirasjon. Elektronet flyt analysen er unik i at kombinasjonen av substrater og hemmere gir mulighet for vurdering av flere komplekser under mitokondrieluft flux 9. Den initiale substratet blanding av pyruvat / malat + FCCP muliggjør evaluering av maksimal respirasjon drevet av Complex I, mens injeksjon av rotenon, etterfulgt av succinat muliggjør vurdering maksimal respirasjon drevet av komplekset II. Injeksjon av antimycin A, en inhibitor av Complex III, etterfulgt av injeksjon av askorbat / TMPD tillate for evaluering av respirasjon drevet av Complex IV ettersom Askorbat / TMPD er enelektron donor til Cytokrom C / Kompleks IV. Mens ingen informasjon om koblings effektivitet oppnås, er metoden ideell for svært små utvalg som utelukker kjører flere underlag uavhengig. Til slutt tillater bruken av palmitoyl karnitin / malat for vurdering av koordineringen mellom β-oksidasjon og ETC siden reduksjonstilsvarende fremstilt fra oksidasjon av palmitinsyre (β-oksidasjon) mates inn i ETC gjennom elektron overføring flavoprotein 15. Det skal bemerkes at koplingen og elektronstrømning assays kan også bli brukt i tandem for å identifisere endringer i mitokondriefunksjon på grunn av noen intervensjon (behandling, genetisk manipulering).
Den høye presisjon oppnås for disse analyser er først og fremst på grunn av grundig blanding av mitokondriene, uansett om det er før proteinbestemmelse, eller med substratet løsninger. Langs disse linjene, er når mitokondriene resuspendend i underlaget løsning;ns, er det avgjørende å blande denne oppløsning grundig før lasting av cellekulturplaten som beskrevet i trinn 2.2 med en utvidet åpning pipettespiss. Unnlatelse av å blande mitokondriene grundig vil føre til store variasjoner i analysen. I tillegg, ved hjelp av en smal åpning pipettespissen vil skape skjærkrefter under blanding av mitochondria og øker potensialet for å skade mitokondrielle membraner og frigjøring av cytokrom C. adherenstrinn (2,7) også er et kritisk trinn i denne protokollen. Unnlatelse av å spinne den belastede cellekulturplaten lenge / hurtig nok vil resultere i ufullstendig klebing av mitokondriene til brønnen, og dermed fører økt variasjon mellom brønnene og målinger.
Den beskrevne protokollen er optimalisert for å inkludere: lasting en optimal mengde av mitokondriell protein per brønn, bruker de riktige konsentrasjoner / tilberedningsmetoder for å gjøre aksje- og underlaget løsninger, endre analysekjøring for å sikre mitokondrie tilstand plateaus, og passende blanding av mitokondrie lager og mitokondrie / substratblandinger. Før disse optimalisering innsats, forfatterne møtte fallgruvene i analysen løp. Følgende diskuterer feilsøkingsmetoder / modifikasjoner som var nyttig i å optimalisere denne protokollen. Med hensyn til optimal lasting, vil laste for lite mitokondriene ikke lokke fram en robust respons, mens lasting for mye mitokondrier vil eksos oksygen inne i mikrokammeret og føre til unøyaktige målinger. Rogers et al 9 gir eksempler på å bestemme optimale laste mengder mitokondrier per brønn for mikro basert respirometrisk analyser. Oftere, er for mye mitokondrier lastet per brønn som dokumentert av staten 2 priser i løpet av 100-200 pmol / min / godt og stat 3 priser> 1500 pmol / min / brønn. Hvis over lasting skjer, utføre et eksperiment med varierende konsentrasjon av mitokondriell protein (f.eks mellom 1 -. 10 mikrogram) for å lokke fram OCRs innenfor den dynamiske range av oksygenforbruksmåling maskin. Klargjøring og bruke de riktige konsentrasjonen av substrater og aksjer er av største betydning. Bruk alltid syreformen av underlag / injeksjoner og justere pH med kaliumhydroksid eller HCl; natrium buffere / løsninger er ikke anbefalt. I tillegg nytt oppslemme substrater / lager i DMSO eller 100% etanol fører til målingsfeil eller feil. Pass på å bruke 95% etanol der det er angitt. Det er vanlig for palmitoyl karnitin å utfelles fra 95% etanol etter tining av frosset lager, og dermed forårsaker stor variabilitet. Husk å varme opp palmitoyl karnitin lager og virvle godt før bruk. I tillegg kan en svært variabel pyruvat / malat assay-resultatet skyldes det pyruvat lager vesen> 2 uker gamle. Sørg for å remake frosne prøver av pyruvat hver 2. uke. Analysen løp ble endret til to-min målinger for å sikre mitokondrielle statlige platåer. Hvis observasjon av utmattelse av ADP er ønsket, forskeren kanutvide måletiden under "Protokoll" fanen under "analysen Wizard" forum. Endelig skjer stor variasjon når det mitokondrielle aksje- og mitokondrier pluss substrat løsninger ikke er homogenisert fullt før lasting. Hvis variasjon mellom brønnene er høy etter at analysekjøring, sørg for å fullt blande substratoppløsningen før neste eksperiment. Aldri vortex mitokondriene / underlaget løsninger, heller røre, mos, og forsiktig triturer med en utvidet åpning pipettespissen.
Det er noen begrensninger i denne teknikken som er verdt å merke seg. For det første er antallet brønner på cellekulturplaten anvendt for disse analyser relativt lav (f.eks., 24 brønner og minst to angitt for blanke brønner). Hvis det er ønskelig å utføre alle fem av disse analyser på en plate, er forskeren bare i stand til å undersøke svarene fra en mus på en gang. Imidlertid bør det bemerkes at 96-brønners instrumenter er tilgjengelige for higher gjennomstrømming. Dernest er det iboende styrker og svakheter i vurderingen av mitokondriell dysfunksjon i isolerte mitokondrier i forhold til i intakte celler 1. Noen svakheter inkluderer å ha mindre fysiologiske relevans i forhold til intakte celler og induserer gjenstander fra isolasjon prosessen. Endelig er suksessen med denne metoden avhengig av kvaliteten på den mitokondrielle isolasjonsprosess.
Selv om noen av disse analyser enten er utviklet i forskjellige systemer, eller har blitt validert i andre dyremodeller, er den første til å syntetisere alle de nevnte analyser for optimal bruk i en multi-brønn oksygenforbruksmåling maskinen ved hjelp av musen metodene som presenteres heri skjelettmuskulatur. Viktigere, kan alle fem av disse analyser utføres med mengden av mitokondriene isolert fra ~ 75 – 100 mg av mus skjelettmuskulatur, noe som gir høy gjennomstrømning med minimal materiale. Av stor betydning, evne til multi-brønnoksygenforbruk teknologi for å utføre analyser med minimale mengder av mitokondrier, kombinert med en optimalisert isolasjonsmetoden, gjør det mulig for forskeren til å utføre en rekke andre forsøk med det gjenværende av skjelettmuskelvevet (f.eks., western blotting, RT-PCR, enzymatiske analyser etc.), som ofte er en kamp med denne dyremodell.
I konklusjonen, metodene som presenteres her gir trinnvise instruksjoner for ytelsen til en samling av mikro basert respirometrisk analyser ved hjelp av minimale mengder av mus skjelettmuskulatur. Viktigere, de presenterte metodene krever minimale mengder vev og mitokondrier. Når mestret, vil de teknikker som er beskrevet her tillater forskere å fastslå en mulig mekanisme av en forbindelse eller genprodukt på mitokondrieoksygenforbruket i et vanlig anvendt dyremodell.
The authors have nothing to disclose.
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
Acid Free- BSA | |||
Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
99%, powder [TMPD] | |||
Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
phenylhydrazone | |||
≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |