La purificación de los buques de cerebro de ratón

El funcionamiento adecuado del sistema nervioso central (SNC) requiere un entorno extracelular altamente regulado, y sus demandas metabólicas son enormes en comparación con otros órganos ^1. El SNC es también extremadamente sensibles a una amplia gama de productos químicos, generalmente inofensivo para los órganos periféricos, pero a la misma, neurotóxico. Para garantizar el correcto funcionamiento, la mayor parte del 'vasculatura SNC forma una barrera endotelial; la barrera hematoencefálica (BBB), que controla el flujo de moléculas e iones, así como el paso de las células inmunes entre la sangre y el cerebro, lo que se mantiene la homeostasis adecuada ^2, sino también limitar la entrada de drogas terapéuticas, los tratamientos que impiden por lo tanto de trastornos neurológicos ^3. A nivel celular, la BBB se sostiene principalmente por extensas uniones estrechas entre las células endoteliales, la expresión de los transportadores de eflujo polarizado y una tasa muy baja transcitosis ^4. Propiedades y funciones de la BBB se inducen principalmente por necélulas ighboring ^4. En particular, los pericitos juegan un papel importante en la inducción y mantenimiento de la BBB ^5,6. Siendo células contráctiles, pericitos también regulan el flujo sanguíneo ⁷ al igual que las células del músculo liso que rodean los grandes vasos. Por último, los astrocitos, las principales células gliales del cerebro, enviar grandes procesos denominados endfeet alrededor de la mayor parte de la vasculatura del cerebro ⁸ y modular la acreditación integridad y la quiescencia inmune ^9, la transferencia de metabolitos a las neuronas ^10, e inducir el estrecho acoplamiento entre la actividad neuronal y el flujo de sangre ^11,12.

La capacidad para estudiar las propiedades moleculares y celulares del sistema cerebrovascular es crucial para caracterizar mejor su contribución a la fisiología del cerebro y la fisiopatología. Para abordar esta cuestión, las estrategias para aislar el sistema vascular cerebral del cerebro se han desarrollado, que permite la preparación de fragmentos de vasos cerebrales intactas. Cerebral buque purification fue descrito inicialmente utilizando cerebros bovinos ¹³ y mejorado y adaptado a otras especies, en particular los roedores ^14. En este último estudio, se introdujo el uso de filtros de diferentes tamaños para separar los vasos cerebrales en al fracciones enriquecidas en los vasos de diferentes diámetros. Curiosamente, en estas preparaciones, las células endoteliales mantienen sus propiedades metabólicas ^15, funcionalidad transportador ^{16 y 17} de polarización. A continuación, describimos en detalle este protocolo y demostrar, además, que los vasos aislados conservan la mayor parte de sus estructuras en situ. Las células endoteliales se mantienen unidos por uniones estrechas y rodeado por una lámina basal continua. Pericitos y células musculares lisas de permanecer unidos a la capa endotelial, así como de astrocitos perivasculares membranas. Sin embargo, se eliminan astrocitos, células microgliales, neuronas y oligodendrocitos. Por último, se describe un procedimiento para llevar a cabo la inmunotinción en vasos cerebrales aisladas. </p>

Hasta ahora la mayoría de los estudios moleculares y celulares en relación con el sistema cerebrovascular se han realizado en células de los vasos cerebrales purificados disociados por la célula de clasificación utilizando cepas reportero ratón específicos de células o procedimientos basados ​​en inmunotinción ^18,19. Aunque estas técnicas permite el aislamiento de las poblaciones de células cerebrovasculares casi puros, células aisladas pierden por completo su in situ morfología y las interacciones, que a su vez, afecta en gran medida sus propiedades moleculares y celulares. El protocolo descrito aquí, lo que permite el aislamiento de fragmentos cerebrovasculares enteros sin necesidad de anticuerpos específicos o manchas de ratones transgénicos, ofrece una buena alternativa como la estructura general de los vasos cerebrales aisladas se conserva, por lo tanto, disminuyendo repercusiones sobre sus propiedades moleculares. Vasos aislados podrían entonces ser utilizados para el estudio de la actividad genética, la síntesis de proteínas y la regulación de la acreditación como se ha descrito recientemente ^20,21 </sup>. Por último, en comparación con láser captura microdissection ^22,23 del presente protocolo es barato, fácil de realizar y rápidamente adaptables a cualquier laboratorio.