Purification de souris vaisseaux cérébraux

Le bon fonctionnement du système nerveux central (SNC) nécessite un environnement extracellulaire très réglementé, et ses besoins métaboliques sont énormes par rapport à d'autres organes ^1. Le CNS est aussi extrêmement sensibles à un large éventail de produits chimiques, généralement inoffensifs pour les organes périphériques, mais à elle, neurotoxique. Pour assurer un fonctionnement correct, la majeure partie du système vasculaire du SNC »forme une barrière endothéliale; la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui commande l'écoulement des molécules et des ions ainsi que le passage des cellules immunitaires entre le sang et le cerveau, ce qui maintient approprié homéostasie ^2, mais en limitant également l'entrée de médicaments thérapeutiques, les traitements entravant ainsi de troubles neurologiques ^3. Au niveau cellulaire, le BBB est principalement soutenue par de vastes jonctions serrées entre les cellules endothéliales, l'expression polarisée des transporteurs d'efflux et un taux de transcytose très faible ^4. Propriétés et fonctions de la BHE sont essentiellement induites par NEighboring ⁴ cellules. En particulier, les péricytes jouent un rôle important dans l'induction et le maintien de la BHE ^5,6. Être cellules contractiles, péricytes régulent également le flux sanguin ⁷ comme les cellules musculaires lisses entourant les grands navires. Enfin, les astrocytes, les principales cellules gliales du cerveau, envoient de grandes procédés mentionnés endfeet autour de la majeure partie du système vasculaire du cerveau ⁸ et moduler Bureau intégrité et la quiescence immunitaire ^9, le transfert de metabolites de neurones ^10, et induire le couplage étroit entre l'activité neuronale et le flux sanguin ^11,12.

La possibilité d'étudier les propriétés moléculaires et cellulaires du système vasculaire cérébral est crucial de mieux caractériser sa contribution à la physiologie du cerveau et de la physiopathologie. Pour aborder cette question, les stratégies visant à isoler le système cérébro-vasculaire du cerveau ont été développées, qui permettent pour la préparation de fragments des vaisseaux du cerveau intactes. Cerebral navire purification a d'abord été décrite en utilisant les encéphales ^{13 et} améliorée et adaptée à d'autres espèces, en particulier les rongeurs ^14. Dans cette dernière étude, l'utilisation de filtres de taille variable a été introduit pour séparer les vaisseaux cérébraux pour des fractions enrichies dans des récipients de diamètres différents. Fait intéressant, dans ces préparations, les cellules endothéliales ont gardé leurs propriétés métaboliques ^15, la fonctionnalité de transporteur et de polarisation ^{16 17.} Ici, nous décrivons en détail ce protocole et démontrent en outre que les navires isolés conservent la plupart de leur dans les structures in situ. Les cellules endotheliales restent liés par des jonctions serrées et entourés par une membrane basale continue. Péricytes et les cellules musculaires lisses restent attachés à la couche endothéliale, ainsi que des membranes d'astrocytes périvasculaires. Cependant, les astrocytes, les cellules de la microglie, les neurones et les oligodendrocytes sont éliminés. Enfin, nous décrivons une procédure pour effectuer immunocoloration sur les vaisseaux cérébraux isolés. </p>

Jusqu'à présent, la plupart des études moléculaires et cellulaires du système vasculaire cérébral concernant ont été effectués sur les cellules des vaisseaux cérébraux purifiés dissociées en utilisant des souches de souris journaliste cellulaires spécifiques ou des procédures sur la base de ^18,19 immunocoloration-tri cellulaire. Bien que ces techniques permettent l'isolement de populations de cellules vasculaires cérébraux presque purs, des cellules isolées perdent totalement leur morphologie in situ et les interactions, qui à son tour, affecte grandement leurs propriétés moléculaires et cellulaires. Le protocole décrit ici, ce qui permet l'isolement de fragments cérébrovasculaires entières sans avoir besoin d'anticorps spécifiques ou les taches de souris transgéniques, offre une bonne alternative comme la structure globale des vaisseaux cérébraux isolés est conservée, ainsi, de diminuer répercussions sur leurs propriétés moléculaires. Vaisseaux isolés pourraient ensuite être utilisés pour l'étude de l'activité des gènes, la synthèse des protéines et de la réglementation à la BBB comme récemment décrit ^20,21 </sup>. Enfin, par rapport à microdissection laser ^22,23 Le présent Protocole est peu coûteux, facile à réaliser et rapidement adaptable pour tout laboratoire.