Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte
Summary
Spine dendritiche di neuroni piramidali sono i siti di maggior sinapsi eccitatorie in mammiferi corteccia cerebrale. Il metodo descrive un'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale nei neuroni piramidali glutamatergici corticali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.
Abstract
Spine dendritiche sono piccole sporgenze che corrispondono ai compartimenti post-sinaptici di sinapsi eccitatorie nel sistema nervoso centrale. Essi sono distribuiti lungo i dendriti. La loro morfologia dipende in gran parte l'attività neuronale, e sono dinamici. Spine dendritiche esprimono i recettori glutamatergici (recettori AMPA e NMDA) sulla loro superficie e ai livelli di densità postsinaptiche. Ogni colonna vertebrale permette al neurone di controllare la propria attività statali e locali in modo indipendente. Morfologie della colonna vertebrale sono stati ampiamente studiati in cellule piramidali glutammatergici della corteccia cerebrale, utilizzando entrambi gli approcci in vivo e colture neuronali ottenute da tessuti di roditori. Condizioni neuropatologiche possono essere associate all'induzione colonna vertebrale alterata e maturazione, come mostrato in roditori neuroni in coltura e analisi quantitativa unidimensionale 1. Il presente studio descrive un protocollo per l'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale utilizzando cortic umanoAl neuroni derivati da cellule staminali neurali (progenitrici fine corticali). Queste cellule sono state inizialmente ottenute da cellule staminali pluripotenti indotte. Questo protocollo permette l'analisi di morfologie della colonna vertebrale in periodi diversi della cultura, e con possibilità di confronto tra le cellule staminali pluripotenti indotte ottenuti da individui di controllo con quelli ottenuti da pazienti con malattie psichiatriche.
Introduction
Spine dendritiche di neuroni piramidali corticali sono piccoli e sottili protuberanze che sono distribuiti lungo i dendriti basali e apicali di questi sottotipi neuronali in roditori, primati, e il cervello umano. Sono i luoghi di maggior sinapsi eccitatorie e visualizzare funzioni chiave nell'apprendimento e processi cognitivi. Le strutture dettagliate delle spine dendritiche umani sono stati tecnicamente studiati da microscopia elettronica 2. Tuttavia, tale approccio è che richiede tempo e rappresenta pesante carico di lavoro. Più recentemente, un tridimensionale (3D) ricostruzione della morfologia delle spine dendritiche è stata riportata nella corteccia cerebrale umana usando software specifico combinato a grandi analisi colonna 3 manuale.
Tecnologia verde proteina fluorescente (GFP) accoppiato ad immunofluorescenza rappresenta uno strumento preciso per l'identificazione della colonna vertebrale e la misurazione forma al microscopio a fluorescenza. Questo approccio può essere facilmente applicato a colture neuronali. However, i dati non sono stati riportati sull'analisi di maturazione della colonna vertebrale e della morfologia dei neuroni umani derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC).
L'obiettivo di questo studio è stato quello di descrivere un protocollo, che permette di spine dendritiche di imaging da colture di neuroni umani in vitro. Etichettatura GFP, microscopia confocale e analisi 3D con il modulo Filament Tracer di software Imaris sono stati utilizzati nel presente protocollo. Cultura passi che sono necessari per ottenere i neuroni glutamatergici corticali degli strati II-IV da cellule staminali neurali (NSC) sono anche brevemente descritto qui. L'intero protocollo per la produzione NSC umano è già stato pubblicato altrove 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
La quantificazione delle caratteristiche morfologiche di neuroni piramidali invocato il software. L'interfaccia Filament Tracer è stato utilizzato per la segmentazione dei neuroni e spine, e il modulo XT è stato utilizzato per l'analisi.
Per analizzare la precisione della nostra tecnica, in primo luogo abbiamo confrontato i parametri morfologici misurati (lunghezza, area e volume totale della colonna vertebrale se applicabile), con quelli pubblicati utilizzando ratto neuroni pirami…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.
Materials
| PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o vit A (50X) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Pen-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
Referencias
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neurociencias. 145, 464-469 (2007).
- Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
- Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
- Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
- Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
- Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
- Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
- Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).
